PK-15细胞的ISG15基因敲除促进PRV的复制

李 琛，何文峰，赵丽娜，凡 启，杨国庆，刘慧敏

(河南农业大学生命科学学院，郑州 450002)

伪狂犬病(pseudorabies，PR)是由伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)引起的可感染多种家畜和哺乳动物的急性传染病，以发热、奇痒(猪除外)及急性脑脊髓炎为主要症状。PRV属于疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科。猪是PRV的唯一自然感染宿主以及长期贮存和传播宿主。PRV感染猪后可建立持续性感染，主要潜伏在猪的外周神经组织，在机体免疫低下或受到应激时可被激活，导致机体发病甚至成为传染源。PRV特殊的致病方式和感染方式给该病的防控带来较大困难，严重危害全球养猪业的发展。近年来，PRV更是突破了常规疫苗，导致猪伪狂犬病的防控难度极大，成为养猪业防控伪狂犬病所面临的巨大挑战。

在病毒入侵机体过程中，宿主产生各种防御机制来保护机体，先天性免疫应答是抵抗入侵病原体的第一道防线。PRV对宿主细胞的感染力很强，能够引起宿主细胞产生免疫反应，诱导产生Ⅰ型IFN，分泌的IFN与其受体结合激活下游信号转导，最终导致数百个干扰素刺激基因(ISGs)的表达。其中，ISG15(interferon-stimulated gene15)作为诱导最强烈、反应最快的ISG蛋白之一，在宿主抵御病毒感染的过程中发挥重要的作用。

近年来，对ISG15抗病毒复制的作用有越来越多的研究。ISG15可以通过作用于病毒入侵的各阶段影响病毒的增殖，也可以作为免疫调节蛋白来调控宿主的反应。本实验室前期研究发现PRV感染能显著上调ISG15，过表达ISG15能明显抑制PRV复制。但是ISG15抑制PRV复制的分子机制尚不清楚，有待进一步研究。在前期试验基础上，本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建15基因敲除PK-15细胞系(PK15-ISG15)，利用PRV毒株检测敲除15基因对PRV复制的影响，以期为进一步研究ISG15抑制PRV 复制的分子机制提供新思路，同时为有效防控猪伪狂犬病提供新的研究策略。

1 材料与方法

1.1 试验材料

猪肾上皮细胞(PK-15)、PRV、ISG15兔多克隆抗体由作者实验室保存；pCompass-LVKO 载体购自Addgene；载体质粒pMD2.G和psPAX2购自Sigma；普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒均购自天根生化科技有限公司；限制性内切酶Ⅰ、RNAiso Plus、PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser、Primer STARMax DNA Polymerase购自宝日医生物技术有限公司；MonAmpSYBRGreen qPCR Mix试剂购自莫纳生物科技有限公司；PRV鼠源gE单克隆抗体购自普莱柯生物工程股份有限公司；β-actin抗体购自赛维尔生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8购自生工生物工程股份有限公司。

1.2 引物设计与合成

根据NCBI网站所公布的猪15基因序列(GenBank No.：NM_001128469)，在15的单一外显子上找到2个合适的靶位点，将此靶序列与猪的基因组序列进行比对，仅在15基因座上找到完全匹配序列，针对2个位点分别设计sgRNA上游引物与下游引物，同时，在基因组靶序列两侧设计15的验证引物(表1)；通过NCBI数据库查询需要检测的基因 mRNA序列，应用Primer-Blast设计RT-qPCR引物(表1)。

表1 引物序列及相关信息Table 1 Sequences and information of primers used in our study

1.3 ISG15基因敲除细胞系的构建

1.3.1 敲除载体的构建 将两对sgRNA引物95 ℃ 5 min进行退火杂交，退火后连接至Ⅰ限制性内切酶线性化的pCompass-LVKO载体中。重组载体送北京擎科生物科技有限公司测序，将测序正确质粒命名为pCompass-LVKO-ISG15-1、pCompass-LVKO-ISG15-2，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取单菌落扩大培养，提取质粒后，-20 ℃保存备用。

1.3.2 敲除细胞系的构建 将pCompass-LVKO-ISG15-1、pCompass-LVKO-ISG15-2与psPAX2、pMD2G以2∶1∶1的比例，共转染HEK293T细胞；培养48 h后收集包装病毒上清液，取1 mL感染PK-15细胞，感染48 h后，用2 μg·mL嘌呤霉素筛选细胞，使用胰酶消化存活细胞，梯度稀释后，按照每孔1个细胞的比例接种至96孔板，37 ℃，5% CO培养扩增细胞。取15完全敲除的克隆，抽提基因组DNA后以此为模板，使用验证引物ISG15 VerF和ISG15 VerR进行PCR扩增，20 μL反应体系：PrimerSTAR Max Premix 10 μL,上、下游引物(0.2 μmol·L)各0.4 μL，模板1 μL，ddHO 8.2 μL。反应条件：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 5 s，共35个循环；72 ℃ 5 min。如果在619 bp处出现一条特异性条带，可初步说明敲除15细胞构建成功，将此条带连接至pEASY-T1 simple载体，随机挑选阳性克隆送公司测序。

1.4 ISG15敲除效率的验证

6孔板铺种PK-15和PK15-ISG15细胞，各设3组重复。培养至细胞汇合度70%左右接种病毒，以PRV MOI=2感染细胞，感染24 h收取蛋白，BCA法检测蛋白浓度。取35 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳后转膜，5%脱脂奶室温封闭1 h后，加入ISG15兔多克隆抗体(1∶5 000)4 ℃摇床孵育过夜，TBST洗膜3次，室温孵育HRP标记的羊抗兔IgG(1∶5 000)1 h，ECL显影。以β-actin作为内参。

1.5 细胞增殖(CCK-8)检测

以每孔1×10个细胞在96孔板中铺种PK-15和PK15-ISG15细胞，每个处理设置5个复孔，培养24 h。参照CCK-8试剂盒在不同时间点向指定培养孔中加入10 μL的CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，随后用酶标仪检测在450 nm处的吸光度。试验重复3次。

1.6 间接免疫荧光检测

12孔板铺种PK-15和PK15-ISG15细胞，各3个重复，培养至细胞汇合度70%左右进行病毒处理，以PRV MOI=2感染细胞，24 h后取出，PBS洗涤两次，然后使用4%多聚甲醛室温固定15 min，使用破膜液渗透15 min。然后用封闭缓冲液(含5%脱脂奶粉的PBS)封闭细胞1 h后，加入鼠源PRV-gE抗体(1∶1 000)4 ℃孵育过夜。PBS清洗后，室温避光孵育FITC标记的山羊抗小鼠抗体(1∶200)，PBS清洗3遍。滴入封片剂平铺覆盖细胞，倒置荧光显微镜下观察。

1.7 实时荧光定量PCR检测

6孔板铺种PK-15和PK15-ISG15细胞，各3组重复。培养至细胞汇合度70%左右进行病毒处理，以PRV MOI=2感染细胞，分别在0、6、12、24、36和48 h收取RNA。TRizol法提取RNA并反转录成cDNA，以cDNA为模板，进行RT-qPCR检测。每个样品3个重复。反应体系20 μL：MonAmpSYBR Green qPCR Mix 10 μL，上、下游引物(0.2 μmol·L)各0.4 μL，cDNA 3 μL，ddHO 6.2 μL。反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火和延伸30 s，共40个循环。以-mRNA表达水平为内参值，计算PRV-0、PRV-、PRV-16、-β mRNA水平。

1.8 Western blot检测PRV-gE蛋白的表达

6孔板铺种PK-15和PK15-ISG15细胞，各3组重复。培养至细胞汇合度70%左右进行病毒处理，以PRV MOI=2感染细胞，感染0、6、12、24、36和48 h收取蛋白，BCA法测蛋白浓度。取35 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳后转膜，5%脱脂奶室温封闭1 h后，加入ISG15兔多克隆抗体(1∶5 000)4 ℃摇床孵育过夜，TBST洗膜3次，室温孵育HRP标记的羊抗兔IgG(1∶5 000)1 h后ECL显影。以β-actin作为内参。Image J软件分析条带灰度值比较ISG15敲除对PRV-gE蛋白表达的影响。

1.9 PRV子代病毒滴定测定

取对数生长期PK-15和PK15-ISG15细胞接种于6孔板。培养至细胞汇合度70%左右，弃去细胞培养物，PBS洗2遍，将稀释好的PRV病毒液400 μL接种到各孔中，置于37 ℃、5% CO培养箱1 h，期间每隔15 min摇晃一次，以便病毒吸附；弃去病毒液，加入含1%琼脂糖细胞维持液覆盖各孔，置于37 ℃、5% CO培养箱培养3 d，取出细胞培养板，10%福尔马林固定30 min，弃去细胞覆盖物，PBS洗2遍，用0.5%结晶紫染色30 min，选择合适的稀释度进行计数。

1.10 ISG15与PRV共孵育试验

取对数生长期PK-15细胞稀释接种于6孔板。培养至细胞融合度70%左右，进行分组处理：第1组直接用PRV(MOI=2)感染细胞；第2组将PRV与BSA于37 ℃孵育1 h后加入细胞；第3组将PRV与ISG15蛋白孵育1 h后加入细胞。吸附1 h后，更换成2%维持培养基，24 h后收取细胞总RNA、总蛋白和上清。分别检测PRV-gE的mRNA和蛋白表达，以及子代病毒的增殖。

1.11 统计学分析

各试验均平行重复3次，通过GraphPad Prism 8.0软件中-test检验方法对数据结果进行统计学分析。

2 结 果

2.1 Cas9/sgRNA载体的构建

为构建15基因敲除PK-15细胞系，针对猪源15的第二外显子，设计了两个特异性的CRISPR-Cas9 sgRNA。利用Ⅰ末端序列将sgRNA克隆到pCompass-LVKO载体上，挑取单个菌落进行DNA测序，测序结果表明，重组质粒pCompass-LVKO-sgRNA构建成功(图1)，提取质粒用于后续试验。

框内序列分别为sgRNA1和sgRNA2序列The sequences in box are sgRNA1 and sgRNA2 sequence respectively图1 pISG15-sgRNA测序结果Fig.1 Sequencing results of pISG15-sgRNA

2.2 PK-15敲除ISG15基因单克隆细胞系的构建

将构建成功的质粒pCompass-LVKO-sgRNA转染PK-15细胞，并以pCompass-LVKO空载体作为阴性对照。转染24 h后进行嘌呤霉素筛选，通过有限稀释法挑选单克隆。单克隆扩大培养后提取细胞总RNA，反转录为cDNA模板对15进行PCR扩增。结果显示,在619 bp处有出现一条特异性条带，初步说明该敲除细胞构建成功 (图2A)。将阳性克隆进行测序鉴定，与对照细胞的序列对比分析结果显示，sgRNA1细胞株的15基因外显子打靶区缺失20 bp碱基，sgRNA2细胞株的15基因外显子打靶区缺失8 bp碱基，选取sgRNA2 细胞株进行后续功能评价，并命名为PK15-ISG15。

A. PCR扩增(M.DL5000 DNA相对分子质量标准；1～3. 阳性克隆细胞PCR结果；4. PK-15细胞为阴性对照)；B. PK15-ISG15-/-单克隆细胞测序结果A. PCR amplification (M. DL5000 DNA marker; 1-3. The ISG15 PCR results of cell colonies; 4. PK-15 cell as a negative control); B. Sequencing results of PK15-ISG15-/- monoclonal cell图2 PK15-ISG15-/-单克隆细胞的筛选Fig.2 Screen of PK15-ISG15-/-monoclonal cell line

2.3 ISG15基因敲除效率的鉴定及对细胞增殖的影响

为验证15敲除效率，Western blot检测PK-15和PK15-ISG15细胞中ISG15蛋白的表达水平。结果表明，在PK-15细胞中可见明显的ISG15条带，而PK15-ISG15细胞中没有检测到ISG15的表达，证实PK-15细胞中15基因完全敲除(图3A)。

A. Western blot检测ISG15敲除效率(1.PK-15细胞；2.PK15-ISG15-/- sgRNA1；3.PK15-ISG15-/- sgRNA2)；B. 敲除ISG15基因对细胞增殖无影响。ns.差异不显著A. ISG15 knockout efficiency by Western blot(1. PK-15 cell; 2. PK15-ISG15-/- sgRNA1 polyclonal cell; 3. PK15-ISG15-/- sgRNA2 polyclonal cell); B. ISG15 gene knockout can induce the replication of PK-15. ns. No significant difference图3 ISG15基因敲除细胞系的鉴定Fig.3 Identification of PK-15 cell line knockout of ISG15 gene

通过CCK-8检测敲除15基因后是否影响细胞增殖活性。结果显示，敲除15基因后PK15-ISG15细胞与PK-15细胞相比，OD波长吸光度值差异不显著(>0.05)，结果表明，15基因敲除对PK15细胞的增殖没有显著影响(图3B)。

2.4 敲除ISG15基因对PRV病毒复制的影响

为了研究ISG15对PRV复制的影响，作者评估了PRV在PK-15和PK15-ISG15细胞中的复制状态。用MOI=2的PRV分别感染PK15细胞和PK15-ISG15细胞，通过间接免疫荧光检测PRV蛋白的表达，发现在感染后的不同时间点，PRV在PK15-ISG15细胞中的表达显著高于PK-15细胞中的表达(图4)。该结果初步表明，敲除15显著促进PRV复制。

荧光显微镜观察PRV感染PK-15及PK15-ISG15-/-细胞对病毒复制的影响(80×)Effect of PRV infecting PK-15 and PK15-ISG15-/- cells on viral replication observed by fluorescence microscopy(80×)图4 敲除ISG15基因促进PRV复制Fig.4 Knockout of ISG15 gene promotes PRV replication

2.5 ISG15基因敲除对PRV不同基因及IFN-β转录水平的影响

为进一步验证15基因敲除对PRV复制的影响，利用RT-qPCR检测PK15-ISG15细胞在感染PRV后的不同时间点，PRV-0、PRV-、PRV-16的mRNA水平。与对照组PK-15细胞相比，PK15-ISG15细胞中 PRV-0、PRV-、PRV-16的mRNA水平极显著升高(<0.01；<0.001)(图5A～C)，表明15基因的敲除显著促进PRV基因转录。

A. RT-qPCR检测感染PRV不同时间PRV-EP0基因mRNA水平；B. RT-qPCR检测感染PRV不同时间PRV-gE mRNA水平；C. RT-qPCR检测感染PRV不同时间PRV-VP16 mRNA水平；D. RT-qPCR检测感染PRV不同时间IFN-β mRNA水平。*.P<0.05; **. P<0.01; ***. P<0.001; ns. P>0.05A. PRV-EP0 gene mRNA were quantified by RT-qPCR; B. PRV-gE gene mRNA were quantified by RT-qPCR; C. PRV-VP16 gene mRNA were quantified by RT-qPCR; D. PRV-IFN-β gene mRNA were quantified by RT-qPCR. *.P<0.05; **. P<0.01; ***. P<0.001; ns. P>0.05图5 敲除ISG15基因促进PRV基因转录、抑制PRV诱导的IFN-β基因转录Fig.5 Knockdown of ISG15 promotes PRV transcription and inhibits PRV-induced IFN-β transcription

同时检测不同时间段-β的mRNA水平，结果显示，PK15-ISG15细胞中-β mRNA水平感染在0～6 h差异不显著；6～36 h时显著低于对照组(<0.05)(图5D)，表明15基因敲除可以显著抑制-β的表达。

2.6 ISG15基因敲除对PRV蛋白表达的影响

相同感染复数(MOI=2)的PRV感染PK-15细胞和PK15-ISG15细胞，并在不同时间点收取细胞总蛋白，Western blot检测结果显示，PRV感染后不同时间PK15-ISG15细胞中 PRV-gE蛋白的表达量显著高于对照PK-15细胞(图6A)。PK-15细胞在感染PRV 12 h时检测到PRV-gE蛋白，而PK15-ISG15细胞在感染PRV 6 h就可以检测到PRV-gE蛋白，并且显示在PRV感染12、24、36 h的PK15-ISG15细胞检测到的PRV-gE蛋白明显高于PK-15细胞。对PRV病毒蛋白的表达进行灰度分析显示，PK15-ISG15中PRV-gE的蛋白表达极显著高于PK-15细胞(<0.001)(图6B)。以上结果表明，15基因敲除促进PRV-gE蛋白表达。

PRV gE蛋白Western blot结果(A)及灰度值分析结果(B)。***. P<0.001Western blot results of PRV gE protein(A)and gray value analysis results (B). ***. P<0.001图6 敲除ISG15基因促进PRV-gE蛋白表达Fig.6 Knockout of ISG15 gene promotes PRV-gE protein expression

2.7 ISG15基因敲除对PRV病毒滴度的影响

为研究PK-15和PK15-ISG15细胞扩增PRV子代病毒滴度的差异，用相同感染复数(MOI=2)的PRV分别感染这两种细胞，通过病毒噬斑法测定并计算PRV的病毒滴度。结果显示，PK15-ISG15细胞的空斑数多于PK-15细胞，并且每个稀释度的空斑数均高于PK-15细胞(图7A、B)。如图7C所示，随着感染时间的增加，PK15-ISG15细胞的病毒滴度显著高于PK-15细胞的病毒滴度(<0.05)，并且在12 h后PK15-ISG15细胞的病毒滴度极显著高于PK-15细胞(<0.001)。结果进一步证实15基因敲除促进PRV的增殖。

A．PRV感染24 h PK-15细胞病毒噬斑(1表示细胞对照；2～6表示病毒4倍梯度稀释，图中按照标号顺序每孔的空斑数量分别为0、1、2、14、40、153个)；B．PRV感染24 h PK15-ISG15-/-细胞病毒噬斑(1表示细胞对照；2～6表示病毒4倍梯度稀释，图中按照标号顺序每孔的噬斑数量分别为0、1、7、26、94、190个)；C. PK15-ISG15-/-细胞与PK-15细胞的病毒滴度。*P<0.05; ***.P<0.001A. Plaque of PK-15 cell at 24 hpi (1. Cell control; 2-6. Virus 4-fold gradient dilution, the number of plaques in each well according to the labeled order in the figure was 0, 1, 2, 14, 40 and 153, respectively); B. Plaque of PK15-ISG15-/- cell at 24 hpi (1. Cell control; 2-6. Virus 4-fold gradient dilution, the number of plaques in each well according to the labeled order in the figure was 0, 1, 7, 26, 94 and 190, respectively); C. Virus titers of PK-15 and PK15-ISG15-/- cell. *.P<0.05; ***.P<0.001图7 敲除ISG15基因促进PRV子代病毒的增殖Fig.7 Knockout of ISG15 gene promotes proliferation of PRV virus

2.8 ISG15蛋白对PRV复制的影响

为了验证ISG15是否通过抑制病毒入侵抑制PRV的复制，将纯化的ISG15蛋白与PRV于37 ℃孵育1 h后感染细胞，通过Western blot、RT-qPCR和病毒噬斑分别检测PRV的蛋白表达、转录水平以及病毒滴度，BSA与PRV孵育作为阴性对照，说明ISG15与PRV的相互作用是特异性的。Western blot检测和灰度分析结果显示，与对照组相比ISG15抑制PRV-gE蛋白的表达(<0.05)(图8A)；RT-qPCR结果显示，PRV-的mRNA水平较对照组显著降低 (<0.05)(图8B)；病毒噬斑结果进一步证实ISG15可以抑制PRV的复制(<0.05)(图8C)。以上结果表明，ISG15蛋白对PRV的抑制作用是通过抑制病毒侵入宿主细胞实现的。

A. Western blot检测不同处理PRV感染后PRV-gE蛋白表达(左)及灰度值分析结果(右)；B. RT-qPCR 检测不同处理PRV感染后PRV-gE基因的mRNA水平；C. 病毒噬斑检测不同处理PRV感染后病毒滴度。*. P<0.05A. Expression of PRV-gE protein after infection with different treatments of PRV by Western blot (left) and gray value analysis results (right); B. Expression of PRV-gE protein after infection with different treatments of PRV by RT-qPCR; C. Virus titer after infection with different treatments of PRV by plaque. *. P<0.05图8 ISG15通过抑制病毒入侵抑制PRV的复制Fig.8 ISG15 inhibits PRV replication by inhibiting viral invasion

3 讨 论

ISG15是由病原微生物IFN诱导产生的，在宿主防御和清除外源病原感染方面发挥重要作用。ISG15已被证明在病毒感染过程中发挥重要作用，既可以通过直接作用影响病毒感染的各阶段，也可以通过间接作用影响病毒感染的宿主信号通路，发挥免疫调节作用。由于作用机理的差异，ISG15在不同病原体之间甚至不同宿主物种之间的重要性可能会有所不同。对ISG15的研究有助于抗病毒药物的研发，也能为干预许多疾病的进展提供新的靶标。本试验利用近年来发展迅速的CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了稳定敲除15基因的PK-15细胞系，选取sgRNA2细胞株进行功能评价，并将该细胞克隆命名为PK15-ISG15，用于研究ISG15对PRV复制的影响及作用机制。

敲低15可促进A型流感病毒(influenza virus，IAV)的复制。Nicholl等研究表明，单纯疱疹病毒Ⅰ型(herpes simplex virus-1，HSV-1)感染可以激活15、等干扰素应答基因，从而抑制HSV-1的复制。Hsiao等研究发现，过表达ISG15可以显著抑制日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)的复制。本课题组前期研究发现，PRV感染PK-15细胞后引起ISG15的表达上调，过表达ISG15显著抑制PRV的复制。然而，ISG15抑制PRV复制的分子机制尚不清楚。本研究利用构建的PK15-ISG15细胞系对15基因在PRV感染过程中的作用加以探究。结果表明，15基因的敲除能够显著增加PRV基因的转录、病毒蛋白的翻译以及病毒的增殖，由此确定了ISG15对PRV具有抗病毒作用，敲除ISG15能够促进PK-15细胞中PRV的复制。

病毒入侵机体后，免疫系统可以识别病毒来源的核酸，诱导产生Ⅰ型IFN、促炎性细胞因子等。Chen等发现PRV感染过程中，ISG20在PK-15细胞中通过增强IFN-β信号抑制PRV复制。ISG15在抑制PRV复制过程中发挥关键作用，在本研究进一步发现，ISG15敲除能抑制IFN-β的表达，推测 ISG15抗PRV复制的作用可能是通过调节Ⅰ型IFN实现，这其中的具体作用机制还需进一步探究和阐明，本文构建的15敲除细胞系可以为该机制的研究提供有力工具。

4 结 论

从PK-15细胞中敲除15并通过IFA、RT-qPCR、Western blot和病毒噬斑评估了15基因敲除后对PRV复制的影响，确定了ISG15对PRV的抗病毒作用。进一步发现敲除15能够抑制IFN-β的表达，在一定程度上促进PRV的复制。本研究为进一步探讨ISG15抑制PRV复制的分子机制提供良好的生物材料。