产气荚膜梭菌噬菌体鉴定及其环境消减效果评价

2022-10-29吴立婷刘半红包红朵庞茂达

畜牧兽医学报 2022年10期

吴立婷，刘半红,2，田源,3，王娟，包红朵，周艳，庞茂达，王冉，张辉*

(1.江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所，江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，南京 210014； 2.陕西科技大学食品与生物工程学院，西安 710021;3.江苏大学食品与生物工程学院,镇江 212013； 4.西北农林科技大学，杨凌 712100)

产气荚膜梭菌(，)是一种革兰阳性厌氧菌，通常存在于人和动物的肠道中，是一种重要的人畜共患病原菌。生肉及其制品在加工过程中可能会被污染而引起人的气性坏疽、食物中毒、胃肠紊乱、肝肾损害等疾病。该菌可分泌多种毒素，目前，已报道有17种以上，根据其分泌的主要致病毒素(α、β、ε、ι)不同可分成A、B、C、D、E共5个类型。其中，A型可分泌α毒素，B型可分泌α、β和ε 3种毒素，C型可分泌α和β2种毒素，D型可分泌α和ε2种毒素，E型可分泌α和ι2种毒素。A型是引起鸡坏死性肠炎(necrotic enteritis，NE)的主要病原菌, 然而细菌耐药及抗生素残留问题日益突出，抗生素作为生长促进剂(antimicrobial growth promoters，AGP)被限制、禁止，从而导致全球范围内鸡NE的发病率显著上升。鸡感染后，会出现肠道黏膜慢性损伤，采食量降低、体重下降、腹泻等症状，料重比升高，产蛋量下降，甚至死亡，给养禽业带来巨大的经济损失。因此，亟需有效的防控细菌性疾病手段和途径。

噬菌体是一类能够感染细菌、支原体、螺旋体、放线菌以及蓝细菌等的病毒，亦称为细菌病毒。其广泛存在于水体、土壤，具有繁殖速度快且容易分离等特点，成为潜在的防控细菌性疾病的候选。噬菌体高度特异，不影响其他菌群；高效且无需反复多次给药；安全无副作用，不会出现抗生素治疗常见的过敏反应和继发感染，同时不会残留在机体内，污染环境等优势，目前，已广泛用于食品、医疗及农业领域。本研究针对禽养殖行业和加工环境中持续存在且难以解决的污染进行了噬菌体的分离鉴定并明晰其作用特性，以期能够用于养殖领域。

1 材料与方法

1.1 Cp菌种来源

菌株CMCC64722及43株不同地区养殖场禽源分离株(表1)均由江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地保存和鉴定。通过厌氧肉汤培养基(含疱肉牛肉粒、石蜡油)，40 ℃ 厌氧培养18～24 h。

1.2 Cp噬菌体分离鉴定

针对山东地区某养殖场肉鸡肠道组织样品，以CMCC 64722为宿主菌进行噬菌体分离。将采集到的病死鸡肠道组织匀浆后，用0.1%缓冲蛋白胨水悬浮，静置过夜，取上清液，5 000×离心20 min，再收集上清液，用0.22 μm微孔滤器过滤。取上述滤液1 mL加入5 mL LB培养液，再加入1 mL对数期 (OD=0.6) 宿主菌悬液，室温静置20 min，37 ℃厌氧培养24 h，过滤后得到噬菌体原液。通过点滴法进行验证：取100 μL宿主菌悬液与0.6% LB混匀后倾注在LB底层平板上，晾干，滴加噬菌体原液5 μL，同时滴加等量LB培养液作为阴性对照，室温放置5 min，干燥后，37 ℃厌氧培养12 h，观察噬菌斑。

1.3 Cp噬菌体电镜形态观察

取纯化后的噬菌体悬液7 μL(>10PFU·mL)滴至铜网上吸附30 min，使用2%磷钨酸(phosphotungstic acid，PTA)负染10 min，室温干燥后，用透射电子显微镜观察并拍摄噬菌体的形态，同时测量头部直径、尾部长度。

1.4 Cp噬菌体外体抗菌活性

分别取1 mL对数生长期的宿主菌CMCC 64722与1 mL 10PFU·mL的噬菌体悬液混匀，静置孵育20 min，加入5 mL 厌氧肉干汤，OD调至0.3左右，设置细菌CMCC 64722对照组，于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6 h读取OD值。

1.5 Cp噬菌体裂解谱

取冻存的43株分离株，挑取单菌落于5 mL厌氧肉汤中，37 ℃厌氧培养。分别取400 μL菌悬液与0.6% LB混匀后倾注在LB底层平板上，待吸收干燥后，滴加10 μL噬菌体裂解液，待吸收后，于37 ℃厌氧培养过夜，次日观察细菌和噬菌斑的生长情况。对各细菌的裂解情况进行统计，分析裂解谱。

1.6 Cp噬菌体一步生长曲线

将噬菌体和宿主菌按照感染复数为10的比例混合，将混合物置于37 ℃ 培养箱孵育15 min，使噬菌体与宿主菌充分吸附，将混合物以10 000×离心2 min，去除上清，将沉淀用厌氧肉汤液体重悬并加至10 mL厌氧肉汤液中，37 ℃、200 r·min摇床振荡培养。每隔10 min取上清，直至120 min，利用双层平板法测定噬菌体效价，重复3次。以时间为横坐标，噬菌体效价的对数值为纵坐标绘制一步生长曲线，并计算爆发量。爆发量=爆发末期噬菌体数目/感染初期宿主菌数目。

1.7 Cp噬菌体最佳感染复数(MOI)

取对数期宿主菌，按MOI 1 000、100、10、1、0.1、0.01、0.001加入噬菌体，37 ℃、150 r·min振荡培养5 h，10 000×、4 ℃离心10 min，取上清，测定各组噬菌体效价。重复3次，各试验组中效价最高的感染复数即为最佳感染复数。

1.8 Cp噬菌体pH及热稳定性

使用浓盐酸或氢氧化钠溶液将PBS缓冲液调整至pH为2～13，取100 μL噬菌体滴加到900 μL不同pH的PBS缓冲液中，37 ℃ 孵育培养2 h后，利用双层平板法测定不同pH条件作用的噬菌体效价。

取噬菌体液(1×10PFU·mL)置于温度为30、40、50、60和70 ℃ 的水浴锅内，孵育培养，并于30和60 min分别取样100 μL，利用双层平板法测定其效价。

1.9 Cp噬菌体全基因组测序及生物信息学分析

参照 High Pure Viral DNA Kit 说明书步骤提取噬菌体基因组。采用全基因组鸟枪法(whole genome shotgun，WGS)策略，构建不同插入片段的文库，利用第二代测序技术(nextGeneration sequencing，NGS)，基于Illumina NovaSeq测序平台，对这些文库进行末端(paired-end，PE)测序。使用ABSS(http://www.bcgsc.ca/platform/software/abyss)和GapCloser(https://sourceforge.net/projects/soapdenovo2/files/GapCloser/)软件拼接全基因组序列，RAST在线数据库(https://rast.nmpdr.org/)注释全基因组序列，所有的开放阅读框使用BLASTp (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在线比对确定基因功能。采用MEGA20.0 软件中neighbor-joining方法对噬菌体进行进化分析。

1.10 Cp噬菌体模拟环境减菌应用

将超净工作台 (840 cm×700 cm×540 cm) 紫外线杀菌1 h后进行环境模拟喷洒噬菌体，采用5 mL无菌喷雾小瓶，在超净工作台内设置5个检测点，编号为A、B、C、D、E (分别位于工作台四角及中心)，每个检测点分别放置3个无盖的含有D-环丝氨酸的LB固体平板。在距离台面40 cm的高度，均匀喷洒细菌及噬菌体；其中，对照组中仅喷洒5 mL CMCC64722(1×10CFU·mL)宿主菌，而试验组喷洒5 mL宿主菌，于5 min后，再次喷洒5 mL噬菌体SD72 (1×10PFU·mL)。在喷洒后，室温作用0.5、1、2 h，利用双层平板法将0.6% LB倾注于LB(含D-环丝氨酸)底层平板上，加盖取出平板，并置于37 ℃ 厌氧箱过夜培养，检测菌落数量，重复试验3次。

2 结果

2.1 Cp噬菌体分离与鉴定分析

以CMCC 64722为宿主菌，从鸡养殖场中的病死鸡体内分离到1株噬菌体vB_CpeS_SD72(简称SD72)，经纯化后观察到清晰的噬菌斑，直径约0.5 mm，呈透明、针尖、无晕圈(图1)。透射电镜观察显示(图2)，该噬菌体具有典型的二十面体头部结构，直径约(50±1)nm，尾部长度约(150±1)nm。根据国际病毒分类委员会(ICTV)第九次报告的病毒分类系统，噬菌体SD72在分类上可能属于尾病毒目()长尾病毒科()。

图1 vB_CpeS_SD72 噬菌斑形态Fig.1 Plaques of phage vB_CpeS_SD72

图2 噬菌体vB_CpeS_SD72 电镜图Fig.2 Transmission electron microscopy of phage vB_CpeS_SD72

2.2 Cp噬菌体裂解活性及裂解谱分析

由图3可知，SD72噬菌体体外裂解效果良好，在作用的前2.5 h有一定抑菌效果，此后至6 h其OD值降至0.2，与宿主菌对照呈显著性差异且菌液显著澄清。

图3 噬菌体vB_CpeS_SD72体外抗菌活性Fig.3 In vitro antibacterial activity of phage vB_CpeS_SD72

由表1可知，噬菌体SD72对43株不同组织来源的A型呈现不同的裂解效果，对36株菌能够被SD72完全裂解，形成清晰且透亮的噬菌斑，裂解率为83.72%。

表1 噬菌体vB_CpeS_SD72宿主谱测定Table 1 Results of phage vB_CpeS_SD72 host spectrum determination

(续表1 Continued)

2.3 Cp噬菌体一步生长曲线

由图4可知，噬菌体SD72的潜伏期为20 min，噬菌体持续增加，此阶段为噬菌体胞外吸附和感染阶段，在20～100 min 时，噬菌体通过其特有的裂解系统裂解宿主菌，导致大量的子代噬菌体释放，噬菌体的效价呈指数增加，是噬菌体的裂解期。100～120 min，噬菌体效价趋于平稳，此阶段噬菌体完成了噬菌体的裂解周期，释放的噬菌体量达到了最高值，爆发生长量为28.5 PFU·cell。

图4 噬菌体vB_CpeS_SD72的一步生长曲线Fig.4 One-step growth curve of phage vB_CpeS_SD72

2.4 Cp噬菌体MOI测定结果分析

当感染复数为0.01时，噬菌体SD72释放的子代噬菌体数量最多，高达1.02×10PFU·mL，其效价为所有感染复数中最高值，是噬菌体SD72的最佳感染复数(图5)。

图5 噬菌体vB_CpeS_SD72 MOIFig.5 MOI of phage vB_CpeS_SD72

2.5 Cp噬菌体pH及热稳定性分析

噬菌体SD72在pH 3～12的条件下无显著性变化(图6)，能够维持较高活力，表明对pH的耐受范围较广，其在pH为8左右时侵染能力仍不受影响，pH分别为3和12时，效价均可维持在90%以上，具有较强的酸碱适应能力。

图6 噬菌体vB_CpeS_SD72 pH稳定性Fig.6 pH stability of phage vB_CpeS_SD72

噬菌体SD72置于不同温度(30、40、50、60、70 ℃)下60 min后测定噬菌体的效价变化(图7)。结果表明，噬菌体vB_CpeS_SD72的生物学活性在30～50 ℃的温度比较稳定，当温度升高至50 ℃以上时噬菌体的效价有下降趋势，但仍能够大量存活，70 ℃水浴处理1 h后，噬菌体SD72效价降低至0, 完全失活。表明该噬菌体在一定温度(30～50 ℃)下可保持良好的热稳定性，能够耐受高温环境，易于保存。

图7 噬菌体vB_CpeS_SD72 热稳定性Fig.7 The thermal stability curve of vB_CpeS_SD72

2.6 Cp噬菌体全基因组分析

全基因组测序结果分析表明(图8)，vB_CpeS_SD72基因组为线性双链DNA，全长41 590 bp，GC含量为28.46 %，平均基因长度为645 bp，未检测到耐药基因、毒力基因及tRNA。vB_CpeS_SD72共注释得到59个开放阅读框 (open reading frame，ORF)，其中，33个ORF与数据库中已公开的功能蛋白有较高相似性(表2)，其他26个ORF注释为功能未知的假定蛋白。此外，在基因组中未发现编码阻遏蛋白、整合酶等与溶源性相关的序列或基因。从基因组结构上分析，预测包装模块：末端酶小亚基 (ORF58，terminase small subunit)、尾部蛋白(ORF34，tail component protein)、原头蛋白酶(ORF53，the prohead protease)、主要衣壳蛋白(ORF44、ORF55，major capsid protein)，该噬菌体基因组中未发现末端酶大亚基序列。预测 ORF28穿孔素(holin)是关于裂解细菌的蛋白，导致细胞质膜电位的崩溃和膜的通透性改变。预测ORF12(single-stranded DNA-binding protein)、ORF1、ORF59(DNA-invertase)ORF2(site-specific recombinase)是参与噬菌体复制与调节的蛋白，包括DNA 结合酶、DNA转化酶、重组酶。为探究噬菌体SD72与其他噬菌体的进化关系，选择ORF58末端酶小亚基蛋白进行系统进化树的构建。从基于小亚基终止酶构建的系统进化树可以看出(图9)，噬菌体SD72与phage vB CpeS-CP51在同一分支，亲缘关系较近，后者在分类上也同样属于长尾噬菌体科。综上所述，噬菌体SD72在分类上应归属有尾噬菌体目长尾噬菌体科。

表2 噬菌体vB_CpeS_SD72 ORF功能分析Table 2 ORFs function analysis of phage vB_CpeS_SD72

扫描文章首页OSID码可查看彩图The color picture can be found by scanning the OSID code on the front page of the article图8 噬菌体vB_CpeS_SD72全基因组结构示意图Fig.8 Schematic diagram of the whole genome structure of phagevB_CpeS_SD72

图9 基于噬菌体末端酶小亚基蛋白序列的系统进化树Fig.9 Phylogenetic tree of phagesterminase small subunit

2.7 Cp噬菌体环境消减应用效果分析

与细菌对照组CMCC64722相比(图10)，在喷洒噬菌体SD72作用0.5 h后，细菌CMCC64722数即从900 CFU(检测点平均值)降至14.8 CFU(检测点平均值)，抑菌效率可达98.36%，能有效抑制细菌生长，起到一定的灭菌作用。噬菌体SD72作用1和2 h后，存活的CMCC64722的数量接近于0，抑菌效率为99.60%。由此可知，0.5 h内SD72可快速高效抑菌，在1～2 h内能达到几乎清除的效果。

图10 噬菌体vB_CpeS_SD72的喷雾灭菌时间分析Fig.10 Bactericidal efficiency of phage vB_CpeS_SD72 spraying based on time

3 讨论

随着新冠疫情影响趋缓，经济逐步复苏，美国农业部(USDA，https://www.ers.usda. gov /data-products/livestock-and-meat-international-trade-data/)报告分析称，全球经济复苏将推动鸡肉需求温和增长，2021年，全球鸡肉产量达到创纪录的1.021亿t，美国鸡肉零售量和年产量位居肉类产品最高，而中国紧随其后成为全球第二大鸡肉消费国。为了满足全球人口动物性食品需求的增量，在规模化食用动物养殖中会添加预防剂量的抗生素以提升生产量，但随之引发了肠道菌耐药性加剧，部分人畜共患病原菌已出现严重的多重耐药性。在欧美国家，由于抗生素的限制性使用，引起的NE发病率呈上升趋势(10%～50%)，在我国禁抗时代的到来，的感染也将会给家禽养殖业造成经济损失。

噬菌体来源于环境，能够特异性对抗细菌且不影响正常菌群，从而受到研究人员及药品研发企业的高度关注。应用噬菌体控制可以在养殖过程中也可以在屠宰加工环节。目前，针对噬菌体的相关研究较少，在国际报道中，Seal等从肉鸡内脏和家禽粪便中分离获得噬菌体ΦCP39O和ΦCP26F，两种噬菌体均有直径57 nm的对称头部，100 nm的非收缩尾，具有尾病毒目成员的特征。俄罗斯联邦莫斯科地区分离到1株强毒短尾噬菌体ΦCPV1及2株短尾噬菌体，即ΦCPV4和ΦZP2，与美国东南部分离出噬菌体ΦCP7R密切相关。Bae等从养鸡场的粪便样本中分离出噬菌体4CJ22，降低了肉鸡肠道中载菌量。Morales等从一个废物处理厂的原始污水中分离出噬菌体ΦCP24R，并对A型具有裂解活性。Volozhantsev等从禽养殖场污水、粪便和肉鸡肠道内容物中分离出烈性噬菌体CPV1，为双链DNA，基因组为 16 747 bp，包含22个开放阅读框。在国内，仅有于旭磊从养殖场污水、粪便等分离纯化 2株具有高裂解率噬菌体CPYS4和CPYS48。

本研究分离获得1株源于禽肠道的新型烈性噬菌体，该噬菌体属于长尾病毒科，潜伏期短，爆发量大，在pH为3～12的环境下具有良好的活力，从而能够适应肠道环境提升其应用潜力；此外，其对温度也能够有良好的耐受特性，在50 ℃ 仍能够维持高效价。噬菌体SD72的潜伏期为20 min，在100～120 min，噬菌体效价趋于平稳，在制备噬菌体制剂时具有一定的时间优势。噬菌体具有相对较广的裂解范围，裂解率高达83.72%，表明SD72是1株强裂解性噬菌体。由此可见，噬菌体SD72作为一种有效、稳定和特异的生物抑菌剂，在预防治疗感染方面有着较为广阔的应用前景和研究意义。

基因组分析表明，SD72呈线性双链DNA，基因组全长约为41 590 bp，与大多数噬菌体基因组相比较大。SD72与vB CpeS-CP51噬菌体全基因组相似性为98.22%， ORF49预测为假定噬菌体蛋白，与vB CpeS-CP51相似性高达79.1%，相关研究针对vB CpeS-CP51进行裂解酶表达，其抑菌效果显著。ORF26预测SD72基因组中包含溶菌酶功能蛋白，与phage phiSM101噬菌体具有一定的相似性。预测 ORF28 (holin)穿孔素是关于裂解细菌的蛋白，因此SD72 被鉴定为一株烈性噬菌体，不具备溶原特性，具有安全性，可以作为一种生物制剂在多领域中应用。

由于是以产孢子的形式存活于自然环境中，不易被杀灭，因此对畜禽养殖及食品生产加工环境构成一定威胁。先前已有将噬菌体以喷雾的方式用于控制养殖环境中的致病菌的报道。此外，噬菌体因其特异高效等特点被认为是对抗致病菌的重要武器，在食品中应用不影响最终产品的感官特性。例如，单核增生李斯特菌噬菌体P100用于奶酪中并不影响奶酪中的功能性乳酸菌，也不会改变食品特性。国外市售的产品，ListShield(含有单核增生李斯特菌噬菌体的混合物)，应用后不会影响预烤火鸡胸肉、熟火腿、博隆尼亚肉和烤牛肉的感官特性(包括味道、视觉和嗅觉)。目前，噬菌体被食品加工厂靶向用于许多病原体，如沙门菌、大肠杆菌O157：H7、志贺菌、产气荚膜梭菌等。本研究中，SD72以高浓度作用于模拟环境控制的污染，在室温作用1～2 h能够有效抑制，减除率高达99.60%，有效降低在环境中的污染风险。