蓝舌病病毒NS4重组蛋白的纯化及多克隆抗体的制备

马骥，李芳，林俊泓，刁洋娟，易华山,，胡庭俊*

(1.广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530005；2.重庆市大足区动物疫病预防控制中心，重庆 大足 402360；3.重庆纳比微特检测技术服务有限公司，重庆 荣昌 402460；4.西南大学动物医学院，重庆 荣昌 402460)

蓝舌病病毒(Bluetonguevirus，BTV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)的虫媒病毒，由库蠓(Culicoides)等节肢动物传播，主要感染反刍动物(牛、羊、鹿等)，导致蓝舌病(Bluetongue，BT)，多表现为亚临床症状，严重时引起口唇发绀、出血、溃疡、面部水肿等，以绵羊病症重且死亡率较高[1, 2]。BTV的成熟病毒粒子为二十面体对称的圆形无囊膜(Non-enveloped)颗粒，基因组由双链RNA(Double-stranded RNA，dsRNA)组成，共10条分节段的dsRNA编码7种结构蛋白(VP1-VP7)和6种非结构蛋白(NS1-NS4、NS3a、NS5)[3-5]。NS4由编码VP6的Segment-9中的重叠ORF编码，长度为77～79个氨基酸且基本不随血清型的变化而变化，存在亮氨酸拉链(Leucine zipper)与驱动核定位的氨基酸残基[3]。NS4在BTV感染细胞的胞浆与胞核中均表达，并与细胞质中的脂滴和核仁存在共定位，还能与dsRNA结合使其不被脱氧核糖核酸酶降解[4]。NS4并不是BTV复制所必需的，但缺失NS4的BTV-8在绵羊体内的毒力减弱[6]。针对感染BTV NS4缺失突变株的转录组分析表明，与野生型相比，BTV NS4缺失突变株中与IFN通路相关的102个基因上调，是一种干扰素通路的拮抗剂[6]。目前，针对BTV NS4拮抗IFN机制的研究主要包括构建BTV NS4缺失株的转录组分析或拮抗IFN信号通路蛋白与BTV NS4的作用靶点等[6,7]。研究表明，NS4以剂量依赖的方式损害IFN信号转导，虽然其单独表达不影响IFN激活的STAT1的磷酸化，但NS4与NS3的共表达可能发挥协同作用而调控STAT1磷酸化、二聚化等[7,8]。

多克隆抗体(polyclonal antibody, pAb)是针对多种抗原决定簇的多种抗体的混合物，相比单克隆抗体而言，pAb也具有制备周期短、成本及技术技能低、稳定性好等优点，并且pAb能识别多个抗原表位而具有良好的特异性[9]。本课题组在前期对BTV NS4真核表达拮抗宿主天然免疫的机制进行了研究[10]，在此基础上，为深入研究BTV NS4重组蛋白免疫原性，本研究进一步对融合蛋白pET-32a-NS4纯化后，免疫新西兰大白兔制备多克隆融合抗体，为研究BTV NS4蛋白的功能及基于BTV NS4检测方法研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

免疫用新西兰大白兔由重庆腾鑫生物技术有限公司提供，NS4蛋白由笔者纯化保存备用，96孔板(9017，美国Costar)。弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均购于Sigma公司；Blue Plus®Protein Marker(14-160 kD)购自全式金生物公司；氯化钠(NaCl)、磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H20)等常规试剂均为国产分析纯。低温高速离心机(Allegra X-30R，美国BECKMAN)、多功能酶标仪(TECAN Infinite 200 PRO，瑞士/TECAN)，其他仪器设备由重庆市兽医科学工程中心提供。

1.2 重组蛋白的纯化及鉴定

取在最佳诱导条件下(37 ℃，0.8 mmol/L IPTG，6h)诱导的菌液各20 mL，3 000 r/min离心5 min后，保留沉淀；1×PBS重悬后，超声裂解0.5 h；4 000 r/min离心10 min(4 ℃)以分离上清液及沉淀；上清液在0.22 μm过滤器过滤后，作为对照备用。利用低压层析系统，将破碎后的上清溶液加入(流速为0.5 mL/min)Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA Sepharose Cl-6B亲和层析柱，直至流出液的OD280值到达基线。用Ni-IDA Washing-Buffer(20 mM Tris-HCl，20 mM咪唑，0.15 M NaCl，pH 8.0)以1 mL/min流速冲洗，直至流出液OD280值到达基线。使用Ni-IDA Elution-Buffer(250 mM咪唑，其余与Washing-Buffer相同)以1 mL/min的流速洗脱目标蛋白，并收集流出物，透析过夜，收集透析液进行SDS-PAGE(12%)分析。孵育一抗THETM His Tag鼠源单克隆抗体孵育2 h；二抗HRP标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(1∶3 000)孵育1 h；PBST洗涤后观察结果。

1.3 包涵体蛋白pET-32a-NS4的复性与浓度测定

在最佳诱导条件下诱导表达的pET-32a-NS4，通过离心之后加入15 mL的裂解液，并将其置于冰水混合物中进行超声破碎。破碎后，在4 ℃ 14 000 r/min离心20 min后取沉淀。使用包涵体洗涤液(20 mM Tris，1 mM EDTA，2 M尿素，1 M NaCl，1% Triton X-100，pH 8.0)清洗包涵体3次；溶解缓冲液(20 mM Tris，5 mM DTT，8 M尿素，pH 8.0)溶解包涵体，4 ℃过夜；4 ℃，14 000 r/min离心15 min；将上述溶液滴加到20 mM Tris-HCl、0.15 M NaCl、pH 8.0缓冲液中，逐渐倍数稀释并慢慢拌混，将蛋白溶液置入透析袋于20 mM Tris-HCl、0.15 M NaCl、pH 8.0溶液中透析过夜。重组蛋白pET-32a-NS4浓度按照BCA方法测定试剂盒说明书测定蛋白浓度。

1.4 NS4多克隆抗体的制备

将纯化的BTV NS4蛋白与完全弗氏佐剂等体积混合充分乳化，于新西兰兔背部皮下多点注射进行免疫，每只 200 μg。首免后第15、30 天用相同剂量与等量弗氏不完全佐剂乳化后加强免疫 2 次。三免后第 14天从心脏采血，血液在 37 ℃静置 3 h 后，置于4 ℃析出血清，分离血清，-80 ℃保存备用。取部分使用ELISA方法检测NS4蛋白的效价，如果效价大于预期(1∶50 000)，则可进行血清收集。

1.5 抗体纯化与鉴定

将NS4蛋白和琼脂糖凝胶偶联制作为抗原亲和提纯层析纯化，用PBS(pH=7.4)稀释NS4蛋白抗原，混匀后在96孔板中每一个孔内依次加入100 μL，包被过夜；弃去包被液，PBST 洗3次，200 μL/孔。在滤纸上轻轻拍干后，每孔加入200 μL封闭液，37 ℃封闭1 h；弃去内液，PBST 洗1次，200 μL/孔;将待测血清稀释后加入板中，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h。取出酶标板，弃去内液，PBST 洗3次，200 μL/孔。山羊抗兔-HRP(1∶50 000)稀释后，在黑暗环境下每孔中加入100 μL，37 ℃避光孵育1 h。取出酶标板，弃去内液，PBST 洗3次，200 μL/孔。每孔先加入100 μL TMB显色液，37 ℃避光显色15 min。每孔加入100 μL HCl(1 M)溶液，终止反应，波长为450 nm测定OD值。以OD450值>0.3且P/N>1.2判断兔血清产生效价的判定条件，利用BCA浓度测定试剂盒对纯化的抗体进行浓度测定及SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色检测纯化的抗体。

1.6 重组蛋白与多克隆抗体Western blot鉴定

将pET-32a-NS4表达产物SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜，碎冰中200 mA恒流转膜40 min，加入封闭液4 ℃封闭过夜。先用His单克隆抗体(1∶2 000)稀释或用本课题组制备的NS4多克隆抗体(1∶1 000)与纯化的重组蛋白，4 ℃孵育过夜，PBST洗6次，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(二抗)以1∶3 000比例稀释，室温孵育1 h，PBST洗6次，显影，使用超高灵敏度化学发光检测仪FUSION FX-XT分析重组蛋白。

2 结果

2.1 重组蛋白pET-32a-NS4的纯化鉴定

为获得纯度较高的重组蛋白，将pET-32a-NS4破碎后分离上清和沉淀，沉淀经Ni柱亲和纯化后SDS-PAGE电泳显示目的条带大小约27 kD(图1)。

A，M：蛋白质分子质量标准；1：pET-32a空载体未诱导；2：pET-32a-NS4诱导后；3：pET-32a-NS4诱导破碎后上清；4：pET-32a-NS4诱导破碎后沉淀；B，1-8：纯化洗脱样品。

2.2 纯化后的重组蛋白鉴定

重组蛋白pET-32a-NS4经Ni柱亲和纯化后，通过SDS-PAGE电泳检测发现在27 kD间有蛋白条带(图2A)。经Western blot鉴定有相同大小蛋白条带，与预期结果相符(图2B)。

A，M：蛋白质分子质量标准；1：0.5 mg/mL BSA；2：纯化后样品；B，M：蛋白质分子质量标准；1、2：纯化后样品。

2.3 抗体鉴定

设定的P/N判定值>1.2，通过ELISA检测NS4抗体效价在1∶512 000以上(图3)。按照BCA浓度测定试剂盒测定纯化后的抗体浓度为1.0 mg/mL，体积为12 mL。

图3 pET-32a-NS4重组蛋白免疫后抗体效价

对纯化的抗体进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色后，仅见到单条的55 kD抗体重链，表明所得抗体的纯度较高，并且通过灰度分析纯化后的抗体纯度大于85%(图4)。以最终获得的12 mL纯化抗体，除去损耗，乘以相应的纯度，纯化抗体得率达到8.0 mg以上。

M：蛋白质分子质量标准；1：抗体纯化分析。

2.4 重组蛋白的Western blot分析

结果如图5所示，在27 kD处可见目的条带，与预期大小一致，表明纯化NS4蛋白多克隆抗体与pET-32a-NS4重组蛋白产生特异性反应。

M：蛋白分子质量标准；1：空白对照；2：0.8 mmol/L诱导6 h产物；3：上清蛋白；4：沉淀蛋白。

3 讨论

BTV NS4作为蓝舌病病毒的非结构蛋白，在拮抗宿主细胞IFN反应与BTV的免疫逃避中发挥重要的功能[6]。本课题组在前期研究中对BTV NS4进行了序列分析，并发现BTV NS4在HEK-293T细胞内表达显著下调仙台病毒诱导的RIG-Ⅰ、MDA5、TRAF6、IRF9、ISG15和IFN-β基因mRNA表达[10, 11]。目前，李一经等[12，13]对25型BTV VP2和VP7蛋白进行单克隆抗体的制备研究。张国芮等[14，15]对BTV VP6和VP7蛋白进行多克隆抗体的制备。张璐及张国芮等[16，17]利用pET-30a表达BTV NS1截短蛋白及 NS2蛋白进行了多克隆抗体的制备研究；车永军等[18]对BTV NS3进行截短表达与多克隆抗体的制备研究，为建立基于结构蛋白的ELISA检测方法及其基因功能研究奠定了基础。而BTV NS4基因在不同血清型BTV氨基酸序列高度保守，是病毒早期感染的诊断靶标[3, 6]。

目前，在动物病毒性疾病监测、净化中，急需基于病毒非结构蛋白的ELISA检测方法，以鉴别野毒感染和疫苗免疫抗体。因此，本研究进一步对构建的BTV NS4原核表达载体pET-32a-NS4在37 ℃，0.8 mmol/L IPTG，诱导6h，超声破碎裂解菌体后，纯化的融合蛋白pET-32a-NS4，免疫新西兰大白兔，成功获得BTV NS4多克隆抗体，效价在1∶512 000以上，具有较好的特异性反应，对进一步研究BTV NS4基因功能及建立基于非结构蛋白的ELISA检测方法奠定了基础。