辛伐他汀对奈必洛尔在体内外代谢的影响

王鹏 陈舒 程樟顺*

奈必洛尔是β受体阻滞剂，主要通过抗交感神经的过度激活预防心血管疾病的发生[1］。辛伐他汀是羟甲戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，在心脑血管疾病防治方面具有广泛的使用[2］。因此，两者在临床中经常联合使用。辛伐他汀会通过影响药物代谢酶改变联用药物的药动学特征，进而改变联用药物的疗效或增加不良反应发生[3-5］。奈必洛尔主要经细胞色素P450 2D6酶（CYP 2D6）代谢，常与联用药物发生药物相互作用[6］。而CYP2D6在辛伐他汀的代谢中也发挥重要作用[7］。这使得两药竞争性代谢性相互作用发生的几率增加。另外奈必洛尔和辛伐他汀均会诱发横纹肌溶解症不良反应[8］。本文探讨辛伐他汀对奈必洛尔体内外代谢的影响，为临床合理联用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂 盐酸奈必洛尔标准品（2016072401，1g，99%）和酒石酸美托洛尔标准品（F0601A，1g，99%）购于上海创赛生物科技有限公司；4-OH奈必洛尔标准品（H948530，1 mg）购于Toronto Research Chemicals（TRC，加拿大多伦多研究化学）。辛伐他汀标准品为实验室前期购置。

1.2 动物 健康雄性SD大鼠，体重250～300 g，由温州医科大学实验动物中心提供。本实验所有动物实验均通过温州医科大学实验动物伦理委员会和温州医科大学实验动物中心审查。

1.3 仪器 ACQUITY高效液相色谱仪，XEVO TQD三重四极杆质谱仪（沃特世科技有限公司产品）；VORTEX-5涡旋混合器（其林贝尔实验室仪器有限公司）；TCL-16G高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；DKZ-450B型电热恒温振荡水槽（上海森信实验仪器有限公司）。

1.4 方法 （1）液质联用（UPLC-MS/MS）分析法：采用ACQUITY UPLC® BEH C18色谱柱（2.1×50 mm，1.7μmol/L），设置柱温为40℃。0.1%甲酸：乙腈为流动相，设置梯度洗脱：初始0.3 min乙腈为40%，然后0.2 min内乙腈由40%升至95%，0.5～1.3 min间保持95%，接着在0.2 min内乙腈由95%下降至40%，1.5～2.5 min乙腈保持40%，回到初始状态。流速设置为0.4 mL/min，进样量为2 μL。整个过程时间为2.5 min。质谱仪电

喷雾接口去溶剂化温度设置为500℃；氮气作为洗脱溶气，洗脱速率为800 L/h。多反应检测（MRM）方式进行定量分析，奈必洛尔m/z 406.28→151.1，4-OH奈必洛尔m/z 422.3→151.1，美托洛尔m/z 268.12→115.8。（2）体内实验方法：将24只雄性SD大鼠随机分成四组，禁食12 h后给药：A组为对照组，灌胃给予10 mg/kg奈必洛尔；B、C、D组为实验组，分别给予辛伐他汀1 mg/kg 、4 mg/kg和10 mg/kg，30 min后给予10 mg/kg奈必洛尔。给药结束后，于0.25，0.5，1，2，3，4，6，8，12，24 h尾静脉采血0.3 mL到含肝素的离心管中，迅速低温离心取出血浆并储存于-80℃超低温冰箱中。（3）体外孵育方法：通过摸索建立以辛伐他汀为抑制剂，奈必洛尔为底物大鼠肝微粒体体外孵育体系。体系共计200 μL，包含奈必洛尔4.05μL（体系中终浓度为20μmol/L），大鼠肝微粒体10μL，不同浓度的辛伐他汀1.6 μL（体系中终浓度为0.01～100μmol/L），还原型辅酶Ⅱ（NADPH）10μL（体系中终浓度为1 mmol/L）和磷酸盐缓冲液174.35 mL（体系中终浓度为0.1 mmol/L）。37℃孵育30 min后储存于-80℃超低温冰箱中终止反应。每组样本设置三个平行管。（4）样品处理方法：从-80℃冰箱取出已终止反应的样品，加入400 μL乙腈沉淀蛋白，加入500 μg/mL的美托洛尔甲醇溶液25 μL作为内标。待样品完全融化后，2 min充分涡旋混匀，13,000 r/min快速离心10 min。取上清液100 μL加入到含有100 μL超纯水的试管中稀释，混匀，2 μL用于UPLC-MS/MS进样检测。

1.5 统计学方法 采用Origin 8软件分析各采血点的血药浓度，根据时间和各时间点奈必洛尔浓度绘制药时曲线。采用DAS 2.0软件，选择非房室模型进行拟合分析，得到大鼠血浆奈必洛尔与4-OH奈必洛尔的药动学参数。采用SPSS 17.0软件对主要药代动力学参数（AUC，MRT，t1/2，Tmax，Vz/F，CLz/F和Cmax）进行统计学分析，比较给抑制剂组和控制组药物代谢的差异。体外研究采用Graphpad Prism 6软件处理大鼠肝微粒体体外数据，绘制抑制曲线并计算IC50值。

2 结果

2.1 UPLC-MS/MS方法专属性 在建立UPLC-MS/MS方法下，各药物的出峰时间为奈必洛尔1.26 min，4-OH奈必洛尔0.71 min，美托洛尔（内标）0.51 min。各化合物单通道出峰，色谱图峰型尖锐对称，血浆样本检测未发现干扰化合物，方法具有良好的专属性。

2.2 辛伐他汀在大鼠体内对奈必洛尔的影响 4组大鼠血浆样品经处理检测后绘制的奈必洛尔药物浓度-时间曲线图见图1，药代动力学参数见表1。其代谢产物4-OH奈必洛尔的药物浓度-时间曲线图见图2，药代动力学参数见表2。辛伐他汀中剂量组（4 mg/kg）中奈必洛尔的达峰时间与对照组比较差异有统计学意义；低剂量组（1 mg/kg）和高剂量组（10 mg/kg）的达峰时间分别高于对照组50%和87.5%。4组间药物曲线下面积（AUC）、药物平均驻留时间（MRT）、半衰期（t1/2z）、表观分布容积（Vz/F）、清除率（CLz/F）和最大浓度（Cmax）差异无统计学意义。

图1 4组大鼠中奈必洛尔药物浓度曲线

表1 奈必洛尔的主要药代动力学参数表（±s）

表1 奈必洛尔的主要药代动力学参数表（±s）

参数 A组 B组 C组 D组AUC（0-t）（μg/L·h）2,908.85±932.68 2,804.43±600.02 2,887.23±899.93 3,356.81±1,327.52 AUC（0-∞）（μg/L·h）3,065.18±935.36 3,060.39±857.10 2,959.05±900.31 3,389.96±1,314.06 MRT（0-t）（h） 4.02±0.18 4.03±0.53 4.57±0.48 5.05±1.05 MRT（0-∞）（h） 4.58±0.05 4.34±0.71 4.86±0.49 5.35±1.14 t1/2z（h） 2.63±0.70 2.65±1.28 2.18±0.73 2.64±0.85 Tmax（h） 1.20±0.45 1.80±0.84 4.00±1.27** 2.25±0.50 Vz/FL/（h·kg） 3.50±0.96 3.47±0.93 3.60±0.92 3.25±1.07 CLz/F（L/kg） 13.60±6.14 12.05±3.48 10.62±1.74 12.81±7.77 Cmax（ug/L） 509.70±134.79 483.52±79.91 453.03±109.42 490.92±61.67

图2 4组大鼠中4-OH奈必洛尔药物浓度曲线

表2 4-OH奈必洛尔的主要药代动力学参数表（±s）

表2 4-OH奈必洛尔的主要药代动力学参数表（±s）

参数 A组 B组 C组 D组AUC（0-t）（μg/L·h）984.65±110.58 896.67±216.18 949.71±130.93 1,038.97±100.75 AUC（0-∞）（μg/L·h）1,110.21±128.03 998.60±328.85 1,011.28±156.05 1,210.49±175.31 MRT（0-t）（h） 8.30±0.38 8.07±0.88 8.03±0.54 8.45±0.37 MRT（0-∞）（h） 11.30±1.99 10.36±2.66 9.67±0.89 12.27±1.70 t1/2z（h） 7.23±1.73 6.52±1.93 5.58±0.93 8.25±1.50 Tmax（h） 2.40±2.07 3.20±1.79 3.50±1.92 2.25±0.50 Vz/FL/（h·kg） 9.10±1.03 10.68±2.54 10.06±1.52 8.38±1.08 CLz/F（L/kg） 94.15±20.70 94.93±6.63 79.97±8.88 98.00±3.45 Cmax（μg/L） 79.85±10.27 72.64±12.43 92.36±14.06 85.71±4.50

2.3 大鼠肝微粒体中辛伐他汀对奈必洛尔的影响 辛伐他汀对奈必洛尔的代谢有明显的抑制作用，且不同浓度辛伐他汀对奈必洛尔代谢表现出不同程度的抑制。100μmol/L浓度的辛伐他汀在大鼠肝微粒体中对奈必洛尔代谢的抑制率为18.78%，IC50值为12.67μmol/L，见图3。

图3 大鼠肝微粒体中不同浓度辛伐他汀对4-OH奈必洛尔生成的抑制作用

3 讨论

奈必洛尔主要经过CYP2D6代谢，除此以外还通过CYP2C19和CYP3A4代谢[9-10］。抑制药物或诱导药物可能会改变奈必洛尔的药代动力学。以往报道临床常用药物氟伏沙明、丁氨苯丙酮、帕罗西汀、氟西汀等均不同程度影响奈必洛尔及其代谢产物的体内代谢过程，进而对药物疗效的发挥造成影响[11-14］。在本研究中，1～10 mg/kg的辛伐他汀对大鼠体内奈必洛尔代谢未见明显影响，而体外结果显示有明显抑制作用。其原因可能是：（1）辛伐他汀经过CYP3A4和CYP2D6代谢，而奈必洛尔比辛伐他汀多了CYP2C19的代谢途径，因此两药在体内联用时，奈必洛尔通过CYP2C19代谢途径可能弱化代谢性相互作用。（2）在研究CYP2D6基因多态性对奈必洛尔代谢影响时，发现在部分CYP2D6变异型中奈必洛尔有自我抑制的现象发生[10］。因此推测奈必洛尔也会抑制CYP2D6，与辛伐他汀合用时主要由奈必洛尔抑制辛伐他汀代谢，而其自身代谢受辛伐他汀影响小。（3）辛伐他汀在人体中的半衰期约4～5 h，奈必洛尔在人体中的t1/2约12～19 h。单次给药物在体内的吸收速率有差异，抑制剂在发挥作用前已经被代谢，因此需进一步研究多剂量给药下两药相互作用的影响。此外，本实验样本量少，具体机制尚未明确，人体中辛伐他汀对奈必洛尔的影响有待于进一步研究。