生物信息学分析相同遗传背景不同转移潜能肺腺癌细胞系Anip973和AGZY83a分泌蛋白的比较定量蛋白质组学研究

高晴，刘赞

(1.东北国际医院, 辽宁 沈阳 110623；2辽宁省检验检测认证中心，辽宁 沈阳110000)

0 前言

肺癌是目前世界范围内发病率和死亡率最高的肿瘤，我国肺癌的发病率及死亡率居所有恶性肿瘤首位[1]。肺癌患者早期症状不明显，导致患者不能及早诊断和治疗。原发性肺癌主要分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌两大类，其中，非小细胞肺癌约占80%，肺腺癌约占32%-40%[2]。由于缺乏特异的临床症状，仅仅表现为咳嗽、呼吸困难或者体重减轻等，75%的患者在就诊是已经处于中晚期，由于其恶性度高，易复发，易转移等特点，绝大多数患者的预后较差，生存时间不超过5年。为延长肺腺癌患者的生存周期，降低死亡率，研究肺腺癌的发生机制以及转移的关键基因，更好的对患者进行早诊显得尤为重要。肿瘤的持续增长、转移和侵袭依赖于肿瘤细胞和/或间质细胞在肿瘤微环境（Tumor microenviroment,TME）中交互作用。TEM是肿瘤存在的环境，包括肿瘤细胞、周围血管和细胞外基质、其它非恶性细胞及信号分子[3-4]。目前的研究认为，肿瘤的持续生长、侵袭和转移依赖于内环境中细胞分泌、分泌途径和分泌蛋白对细胞微环境的交流和信息传递。并且，微环境中的肿瘤细胞和其它细胞分泌的细胞外基质成分和其它分子是肿瘤潜在标记物和治疗药物靶点的丰富来源[5]。基于质谱的蛋白质组学技术在过去的十年里发展迅速，在肿瘤标记物的筛选、分类、发生发展机制、治疗和预后评估等方面承担重要角色。多种标记物联合检测的灵敏度和特异度都较单一的标志物检测更高[6]。比较蛋白质组学是对蛋白质组的整体进行分析，从蛋白质的表达水平、表达数量、修饰状态上进行比较，得出蛋白质组见的差异，为肿瘤诊断标志物的筛选提供了全新的思路。同位素标记相对和绝对定量技术（Isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ）可同时对8个样品进行直接定量比较，结合液相色谱质谱联用技术（iTRAQ-LC-MS/MS），具有灵敏度高、适用范围广、特异性强、定量精准、重复性好等优点。目前，分子诊断以血清学为主，其中高丰度蛋白占99%，低丰度蛋白不足1%，低丰都蛋白虽然稀少，但肿瘤标志物主要储存于这些蛋白中[7]。

分泌组（Secretome）是指从活细胞内合成，分泌到胞外起作用的蛋白质，参与细胞信号转导、细胞间通讯、细胞迁移等过程。肿瘤细胞基因表达的改变和机体对肿瘤的反应均可引起释放在肿瘤微环境中的分泌蛋白的表达异常，进而可能引起肿瘤的增值、分化、凋亡、转移和侵袭[8]。研究肺腺癌病理改变导致的分泌蛋白表达的改变，对于我们筛选肺腺癌血清标志物、诊断和预后和疗效检测都有重要的意义。

本研究对同一来源的高低转移能力的Anip973、AGZY83a 以及正常肺支气管上皮细胞系的8-plex iTRAQ定量结果进行了比较蛋白质组学分析研究，以期发现肺腺癌转移相关标志物，进一步筛选可用于肺腺癌预后及干预的潜在标志物。

1 材料与方法

1.1 细胞系与细胞培养

人肺腺癌细胞系Anip973与AGZY83a 细胞系购自上海拜利生物有限公司（https://www.bioleaf.com/），此两株细胞于液氮中保存于哈尔滨医科大学病理教研室。

Anip973、AGZY83a 、HBE细胞系于含表皮生长因子（rEGF）和牛垂体提取物(BPE)的无血清培养基中 (Invitrogen, formerly GIBCO-BRL, Cat. No.17005-042)在37℃、5% CO2的条件下孵育至细胞丰度达80%左右时，取培养基1500rpm离心，10分钟后取上清进行分泌蛋白提取。

1.2 分泌蛋白提取

将收集的上清装于透析袋(3500Da, Millipore,Billerica, MA, USA)分别在100mmoL、50 mmoL、25 mmoL、10 mmoL NaCL 透 析 液 中2h,4h,8h,12h进行梯度透析，最后放入两蒸水中24小时之后放入-80℃过夜。过夜之后的固体状态的透析液真空浓缩系统(Heto-Holten,Aller d, Denmark)12h-14h直至固体粉末状态。

1.3 蛋白消化和iTRAQ 标记

将Anip973和AGZY83a 溶解于裂解缓冲液中[8M尿素(GibcoBRL)、4% CHAPS（Calbiochem)、10 mM DTT(Pro-mega)、1 mM PMSF (Amesco)、2mM EDTA (Ame-sco)]。DTT 10mM，56℃ 1h，IAM 55mM，避光45min，进行蛋白烷基化。酶（Promega）：蛋白质=1:30，37℃，共消化36小时，消化24小时之后，补加底物质量的1/100Trypsin。使用8-标iTRAQ 试剂盒（(AB Sciex, Foster City, CA, USA）进行样本标记：将70μL异丙醇加到标记试剂中进行复融，并且消化的肽段标记于不同的iTRAQ 试剂上（Anip973 和AGZY83a分别标记117、119），室温孵育2h，将3个样本的肽段放入真空浓缩仪。

1.4 强阳离子交换

强阳离子交换(SCX)采用岛津LC-6AD高效液相色谱泵系统，将在4mL缓冲液A(10 mMKH2PO4，25% ACN，pH 3.0) 消化的肽段加入4.6×250mm的Ultremex 强阳离子交换柱(Phenomenex)。肽段在A缓冲液中以1mL/min的流速进行梯度洗脱20min,采用逐步提高阳离子浓度的洗脱的方式将大部分肽段洗脱下来,洗脱下来的肽段分为12部分通过Strata X C18柱（Phenomenex）脱盐并真空干燥。

1.5 液相色谱-串联质谱分析

结合在线毛细管液相色谱系统(Famos,Switchos, Ultimate; Dionex, Amsterdam, Netherlands)，采 用micrOTOF-Q II (Bruker Daltonics, Bremen,Germany),进行肽组分的纳米流电喷雾串联质谱分析。

1.6 蛋白鉴定与定量

使 用MASCOT 软 件（Mascot 2.3.01 software,Matrix-Science)进行数据分析，使用Swiss-Prot 57.15人类蛋白质序列数据库（515,286 条序列），搜索时利用以下5个特异性参数：（1）肽和碎片离子的质量公差±0.5Da；（2）一个缺失的酶蛋白酶裂解；（3）氨基甲基半胱氨酸固定化修饰；（4）氧化变量；（5）iTRAQ 8标-复合物（K），iTRAQ 8标-复合物（N-末端），iTRAQ 8标-复合物（Y），氧化（M）。

1.7 信号肽预测与基因本体功能标记

将蛋白序列输入 SecretomeP2.0 和SignalP4.0 servers (http://www.cbs.dtu.dk/services)预测蛋白的通路，使用AmiGO version 1.8 software (http://amigo.geneontology.org)预测差异分泌蛋白的功能，所分析的差异分泌蛋白分类为：细胞组成，分子功能和生物学过程。

1.8 免疫印记分析

RIPA裂解液裂解细胞或组织提取肾皮质组织全蛋白，取40μg上样，在SDS-PAGE胶体中电泳分离，转移至PVDF膜(300mA，100min)，含5%脱脂奶粉的PBST室温封闭60min，4℃过夜孵育一抗(ALPP稀释比例分别为1:2000)，洗去未结合的一抗，加入HRP偶联二抗(1:5000稀释)室温孵育60min，最后用ECL化学发光法曝光、显影、定影，扫描胶片并保存数据。

2 结果与分析

2.1 iTRAQ实验结果

为鉴定肺腺癌转移相关血清标志物，iTRAQ标记的三株株细胞系Anip973、AGZY83和HBE的分泌蛋白经NCBI 数据库共鉴定492个差异表达蛋白，当设置(117/119，117/113,119/113)取＞1.5或＜0.667并且至少含有一个特异性肽段时，Anip973与AGZY83a比较的差异蛋白表达共161个，Anip973与HBE比较的差异蛋白表达共86个，AGZY83a 与HBE比较的差异单蛋白表达共98个。经IPA 数据库进行分析，与肿瘤迁移、血管生成、增值、黏附、侵袭相关的蛋白，见表1。

表1 IPA 数据库肿瘤标记物富集

2.2 目的差异分泌蛋白的基因本体注释

见图1。

图1 同一遗传背景不同转移能力的2株细胞系Anip973和AGZY83a差异蛋白表达的蛋白质组比较的细胞组分注释、分子功能注释、生物学过程注释。

2.3 Western Blot 实验结果

iTRAQ 实验结果显示，同一遗传背景不同转移能力的两株细胞系Anip973和AGZY83a比较，ALPP蛋白在AGZY83a细胞系分泌蛋白中高表达（见图2）。

图2 ALPP蛋白在相同遗传背景相同转移能力不同的Anip 973细胞系和AGZY83a细胞系的分泌蛋白中的表达情况

续表1

3 讨论

本实验采用iTRAQ 标记定量的方法，比较两株遗传背景相同转移能力不同的肺腺癌细胞肺癌细胞系Anip973和AGZY83a的分泌蛋白表达差异，以寻找肺腺癌转移相关分子。

腺癌作为最常见的肺癌病理类型，约占到NSCLC的40%[9]。由于临床症状隐匿，很多患者就诊时已经为中晚期，有的已经发生远处转移，丧失手术机会，预后较差。随着靶向药与免疫治疗的推广应用，无法进行手术的晚期肺癌患者的5年生存率有所提高，目前早期诊断的手段主要采用低剂量计算机断层扫描技术，这使得肺癌的早期诊断率有所提高。随着蛋白质组学研究的进展，iTRAQ标记技术与高敏感性、高准确性的串联质谱以及多为液相色谱联用已经成为蛋白质定量、定性的主要研究工具。分泌蛋白可以通过复杂的途径进入唾液、血液或者其它体液中并且可以用作唾液、血液、或其它体液检测的蛋白标志物[10]。这些蛋白标志物的变化可以为检测组织或者器官的生理状态提供线索，对疾病做出及时的检测和诊断。

本研究对鉴定的差异分泌蛋白进生物信息学分析，首要在IPA 数据库分析了与迁移、转移、血管生成、增殖、粘附以及侵袭相关的蛋白，并且选取了与白细胞迁移、腺癌、肝癌、胆管癌、性腺肿瘤、肺癌、子宫癌、生殖器肿瘤、宫颈癌、睾丸癌等肿瘤相关的ALPP 蛋白进行免疫印迹验证。在肝肿瘤转移的相关基因进行基因芯片研究结果表明，与对照细胞MOCK 细胞比较稳定转染FATE/BJHCC-2的肝癌细胞5B4,出的差异蛋白中，ALPP基因表达量明显下降[11]，这表明ALPP 在肝癌转移中发挥这某种作用。本研究结果为ALPP 蛋白在相同遗传背景的两株不同转移能力的肺腺癌细胞系Anip973 、AGZY83a 比较中，低转移潜能细胞系AGZY83a 中表达月高转移潜能细胞系Anip973的3倍，这表明，ALPP过某种机制抑制肺腺癌的转移，其发挥作用的具体靶点以及相关机制有待于进一步的研究。