基于网络药理学分析沙棘治疗风湿性心脏病的作用机制

万敬强，郭振东，马永霞，谢萍

（1.甘肃中医药大学 第一临床医学院,甘肃 兰州 730000；2.甘肃省人民医院 心内科,甘肃 兰州 730000）

0 引言

风湿性心脏病（rheumatic heart disease，RHD），是由A组B溶血性链球菌感染所致（多为咽颊炎），其机制与链球菌感染后异常免疫反应有关，心瓣膜受损是风湿热最严重的临床表现，主要累及二尖瓣和主动脉瓣。本病早期可无症状，随着瓣膜狭窄与关闭不全的逐渐加重，最终发展为顽固性心力衰竭，需要外科换瓣治疗[1]。目前主要治疗方式为定期肌肉注射抗生素控制疾病的发展，尽管如此，仍有部分患者预后不良，最终发展为心力衰竭。流行病学研究发现RHD占所有心血管死亡的1.6%，每年全球约30万人死于RHD[2]。西医对风湿性心脏病的发病机制认识不明，可能机制与链球菌感染后异常免疫反应有关，迄今为止，无特效药物，现迫切需要开发毒副作用较小的药物。

沙棘广泛分布于我国西北、华北等地，研究发现其具有抗炎、抗氧化、利肝、降脂、保护心血管等药理活性[4]。沙棘中发挥保护心血管作用的当属黄酮类物质，其主要通过调节Ca2+信号通路、ROS信号通路等信号途径，参与调节脂质代谢、氧化应激、保护内皮细胞等过程，来改善心功能[5]。

网络药理学是药理学和生物信学的结合学科，通过网络分析，阐明药物-疾病-通路的潜在关系，为中医药新药研发与老药新用提供一定的理论基础[3]。与此同时，网络药理学旨在阐明中药整体性和人体疾病之间的对应关系，与中医药整体观、辨证论治的原则相吻合[6]。因此，本文基于网络药理学分析沙棘治疗风湿性心脏病的可能靶点和分子通路，为临床研究提供依据。

1 方法和资料

1.1 数据库与软件来源

网络药理学研究以网络数据库平台为主[7]，本文所用数据库网址见表1。

表1 本文所用数据库网址

1.2 方法

1.2.1 沙棘中目标化合物筛选

以“沙棘”为关键词，在TCMSP数据库中检索，以OB≥30%和DL≥0.15为限定条件。利用PubChem数据库查询以上活性成分的化学结构式和PubChem CI[8]。

1.2.2 沙棘活性成分作用靶点收集

通过TCMSP检索获得沙棘活性成分对应的靶点。将每种成分对应的靶点以表格形式保存至EXCEL中，分类去重处理后，让数据更有条理性，以便后续的统计操作。利用UniProt知识库，搜索获得沙棘活性成分靶点对应的基因，选择分类为Human/Homo（人类）的基因，保存至相应蛋白靶点之后[9]。

1.2.3 风湿性心脏病相关基因检索

将风湿性心脏病、风湿性心肌炎等词输入pharmaGKB、Disgenet、OMIM数 据 库，筛 选 出疾病潜在靶点，下载搜索结果并保存为EXCEL格式。

1.2.4 药物作用靶标与风湿性心脏病靶标的获取

将沙棘活性成分作用靶点对应的基因集复制粘贴至新的EXCEL中，剔除重复项后与RHD的相关靶点取交集，从而筛选出沙棘治疗RHD的共同靶点。

1.2.5 沙棘活性成分靶标构建

将Pelargonidin、canthaxanthine、carotenoid、cislycopene、delta-Carotene、ergosta-7-en-3-betaol、ergostenol、gamma-carotene、LAN、Mandenol、rhein、24-epicampesterol、beta-carotene、isorhamnetin、beta-sitosterol、Schottenol、CLR、quercetin等活性成分的靶标上传到 Cytoscape 3.8.0软件中，构建沙棘活性成分靶标网络。

1.2.6 靶标互作（protein-protein interaction，PPI）网络的构建

在STRING数据库首页，选择“Multiple Proteins”选项，在List of Name栏输入沙棘和风湿性心脏病的交集靶标，Organism选择为“Homo Sapiens”，然后点击Search进入，在Setting选项栏选择将相互作用阈值设置为“Medium Confidence（中等置信度）”0.4[10]，获得药物与疾病靶标相互作用关系，将获得的数据导出EXCEL中。最后利用Cytoscape3.8.0软件进行蛋白网络关系图的制作。

1.2.7 GO功能富集分析与KEGG通路富集分析

将沙棘和风湿性心脏病疾病的交集靶标导入DAVID数据库中，Select Identifier选择“OFFICIAL_ GENE_SYMBOL”,List Type选 择“Gene List”，Organism选 为“Homo Sapiens”，点击Functional Annotation Tool后 再 选 取“Gene Ontology”下 的“GOTERM_BP_DIRECT”以 及“pathways”下的“KEGG_PATHWAY”将数据导出，然后再应用微生信平台进行数据可视化处理。

2 结果

2.1 沙棘有效成分筛选

以OB ≥ 30%、DL ≥ 0.18 为筛选条件，通过TCMSP数据库筛得到18种沙棘的活性成分。如表2所示。

表2 沙棘治疗RHD主要活性成分及靶点

2.2 沙棘活性成分的网络构建

如图1所示，该网络包括472条边和18个节点，连接数较多的节点在整个网络中起着举足轻重的作用，可能是核心活性成分或者关键靶点。其中异鼠李素（isorhamnetin）、大黄酸（cislycopene）、槲皮素（quercetin）、亚油酸乙酯（Mandenol）等具有较强的药理活性。

图1 沙棘与风湿性心脏病交集靶点Venn图

2.3 沙棘与风湿性心脏病靶标PPI网络构建

沙棘与风湿性心脏病共同靶标共包括37个节点，如图2。Degree值越大则节点颜色越深，且节点越接近图中圆心，如图3。沙棘治疗风湿性心脏病的靶标中Degree值排名前4位的靶标为STAT3、AKR1C3、TNF、MMPs。

图2 沙棘活性成分网络图（PPI）

图3 沙棘治疗风湿性心脏病共同靶标PPI网络图

图4 活性成分对应靶标的GO生物过程分析

2.4 GO生物过程和KEGG通路富集分析

沙棘治疗风湿性心脏GO富集分析发现，沙棘作用途径大多与胶原蛋白代谢过程、细胞外基质分解、MAPK的激活、基因表达调控、RNA聚合酶Ⅱ促进器转录的正调控等有关；KEGG富集分析发现，沙棘可调节TNF信号通路、代谢信号转导通路、HIF-1信号通路等来发挥作用。

3 讨论

在沙棘-活性成分-靶标网络图分析发现，一种活性成分作用于多个靶标、通路，这恰巧体现中医的整体优势。其中槲皮素、异鼠李素属于黄酮类化合物，具有较强的抗氧化活性，可直接清除心肌组织中的超氧歧化物、自由基、过氧化氢等氧化性物质，刺激心肌细胞产生超氧歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等还原性物质，从而发挥抗炎抗氧化功能，保护心肌组织。研究表明槲皮素可通过抑制ROS过度生成而抑制P38-MAKP介导的心肌纤维化的发生[11]；槲皮素通过改善糖尿病大鼠心肌组织的氧化应激、炎症和细胞凋亡而减轻心肌损伤[12]；研究表明，异鼠李素通过影响线粒体凋亡途径和激活Nrf2/ARE信号通路来保护心肌细胞免受H2O2诱导的损伤[13]。异鼠李素通过抑制氧化应激、线粒体凋亡途径和MAPK信号转导途径改善阿霉素诱导的心肌损伤[14]。有研究表明大黄酸要用价值高，研发前进广泛，大黄酸具有抗肿瘤、抗纤维化、调脂、降血糖、抗菌抗病毒等广泛的药理活性，广泛应用于心血管疾病[15]。

图4 活性成分对应靶标的KEGG通路富集分析

风湿性心脏病PPI网络中靶标STAT3、TNF、MMP1、MMP3、MMP9、IGFBP3、MAPK14 高表达。STAT3作为信号传感器和活化剂是由多种生长因子和细胞因子参与的关键信号蛋白，能够引起不同的生物结果，包括细胞生长、分化和存活[16]。AKR1C3是醛酮还原酶超家族的家族成员之一,目前研究发现与多种肿瘤发病密切相关。TNF-α作为炎性指标，在多种恶性肿瘤、各器官功能衰竭、感染性疾病[17]等病理条件下均升高。其中MMP家族矩阵金属蛋白酶 （MMPs）是蛋白分解酶家族，在细胞外基质（ECM）组件的降解和合成中非常重要[18]。IGFBP-3是调节细胞增殖、凋亡和纤维化等细胞过程的基本蛋白质，执行各种生理功能[19]。MAPK14作为p38MAPK信号通路的关键分子，是多种激活下游多种炎症的核心环节，在病原微生物感染引起的免疫应答过程中发挥重要作用[20]。上述关键靶标其中TNF-α、MAPK14介导了炎症因子的合成与释放，说明沙棘在风湿性心脏病治疗中发挥抗炎具有重要意义。IGFBP-3、MMPs与纤维化通路密切相关，表明沙棘在治疗RHD晚期顽固性心力衰竭中具有重要意义。

GO 生物过程主要集中于氧化应激、细胞外基质的沉积、胶原蛋白活化、MAKP通路。KEGG通路分析结果显示:通路主要涉及TNF信号通路、HIF-1信号通路，关于TNF信号通路，TNF-α抑制β-肾上腺素能受体，负反馈导致交感神经激素分泌增加，进一步促进机体释放促炎因子，加重了组织细胞损伤，同时激活心肌肥厚和心力衰竭的信号通路[17]。HIF-1α是一种氧敏感转录因子，在常氧条件下极易被降解，因此，当发生心肌缺血时，受损的心肌细胞与内皮细胞可释放IL-1β、IL-6、TNF-α等一系列细胞炎性因子引起局部炎症反应，从而加重组织损伤[21]。

本文基于网络药理学方法，构建沙棘治疗RHD的“成分-靶点-通路”作用机制。结果表明，沙棘主要是以黄酮类化合物槲皮素、异鼠李素等18种活性成分为物质基础，以STAT3、TNF、MMP1、MMP3、MMP9、IGFBP3、STAT3、MAPK14等8个蛋白作为主要作用靶点，经由TNF信号通路，HIF-1α信号通路等抗炎抗氧化相关通路起到治疗作用。因此，本文预测的沙棘“多成分-多靶点-多通路”的作用机制，可为进一步深入开展沙棘治疗风湿性心脏病作用机制研究提供新的路径和方向。