乌鲁木齐市某羊屠宰场沙门氏菌污染调查及分离株耐药性检测

2022-10-27曹婉怡彭斌朱亚磊赵琴王金泉

现代畜牧兽医 2022年9期

曹婉怡，彭斌，朱亚磊，赵琴，王金泉

（新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052）

沙门氏菌是革兰氏阴性兼性厌氧细菌，于19世纪首次分离出猪霍乱沙门氏菌（Salmonellasp.）[1]。作为人畜共患传染病的主要传染源之一，沙门氏菌传播途径多样，经食物链可引起人和多种动物的急性或慢性传染病[2]。肉制品作为沙门氏菌的携带体，屠宰加工时可通过操作人员、加工工具、运输等途径携带并传播沙门氏菌[3]。

目前，沙门氏菌耐药现象较为普遍[4]。Kroger等[5]对149株沙门氏菌进行10种以上的抗生素耐药检测，结果显示，超过七成样品存在不同程度的耐药，其中超半数对两种或两种以上药品敏感。在广州地区进行非伤寒菌株耐药性调查发现，氨苄西林的耐药性最高，磺胺甲基异恶唑、头孢他啶和环丙沙星也呈较高的耐药性[6]，表明存在一定的安全隐患[7]。本研究以乌鲁木齐某羊屠宰场为样品采集地，对该地沙门氏菌的流行情况进行调查，并进行多种抗生素敏感试验，以期为沙门氏菌的防控与治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品采集

2021年5月在乌鲁木齐市某羊屠宰场采集112份样品（57份羊胴体拭子、30份羊肠内容物、25份操作环境拭子）。无菌生理盐水浸润的棉签涂抹羊胴体表面、操作工具及操作台表面；刮取羊肠内容物后，立即放入提前准备好的甘油肉汤中并标记，24 h内送回待检。

1.1.2 标准菌株

鼠伤寒沙门氏菌ATCC13311，保存于新疆农业大学动物医学学院畜产品质量安全实验室。1.1.3试剂与仪器

主要试剂：营养琼脂（NA）、四硫磺酸钠煌绿增菌液基础（TTB）、亚砷酸盐胱氨酸增菌液（SC）、MH肉汤、LB肉汤、缓冲蛋白胨水（BPW）、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（XLD）、亚硫酸铋琼脂（BS）、0.1%煌绿溶液和碘溶液、PCR相关试剂均购自青岛日水生物技术有限公司。

主要仪器：恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、基因扩增仪（PCR仪）、凝胶成像系统GELDOCXR（BIO-RAD公司）。

1.1.4 引物序列（见表1）

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

根据参考文献确定inv A基因[8]并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.5 药敏试验材料

选取11种药物的药敏纸片，包括：β-内酰胺类：氨苄西林（AMP）、头孢噻肟（CTX）、头孢曲松（CRO）；氨基糖苷类：卡那霉素（KAN）、庆大霉素（GEN）、妥布霉素（TOB）；喹诺酮类：环丙沙星（CIP）、诺氟沙星（NOR）、氧氟沙星（OFX）；四环素类：四环素（TET）、酰胺醇类：氯霉素（CHL）；均购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 分离纯化

根据参考文献[9]的方法操作。吸取2 mL含有样品的甘油肉汤加入装有2 mL BPW的灭菌离心管中，37 °C培养箱中培养24 h。培养后的样品进行分装处理，取1 mL培养液加入10 mL TTB（加入0.1%煌绿溶液、碘溶液，每100 mL/支）内，再取1 mL培养液加入10 mL SC内。将两种增菌液做好标记均放入37℃培养箱内振荡培养24 h。取出培养后的菌液，采用灭菌后的接种环蘸取菌液一环，分别在XLD和BS平板上，使用平板划线法涂布，分别放入37和42℃环境中培养24、48 h；重复前一步骤3～4次，即得到理想菌落。

1.2.2inv-APCR鉴定

使用水煮法[10]提取模板；反应结束后，将与预期片段大小一致的产物进行测序、比对。

PCR扩增体系：2×Taq PCR Master mix 10 μL、inv AF 1 μL、inv A-R1 μL、超纯水11 μL、模板2 μL。

PCR扩增条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，59℃退火45 s，72℃延伸45 s，共35个循环；72℃再延伸10 min。

1.2.3 保菌

阳性菌复苏培养，取单一菌落进行纯培养，使用60%甘油以1∶1比例将阳性菌制成甘油菌，-20℃保存。

1.2.4 药敏试验

使用上述药物对阳性分离株采用纸片扩散法进行药敏试验。采用灭菌棉拭子蘸取复苏后的菌液，均匀涂布于营养琼脂平板；依次放置药敏片，纸片之间距离为2 cm，37℃培养24 h，以标准菌株作为质控菌株并做2个平行重复，测量抑菌圈直径以便判断结果。结果表现依据标准[11]进行判定，分为耐药（resistance，R）、中介（intermediary，I）及敏感（sensitive，S）。

2 结果与分析

2.1 分离纯化结果（见图1）

由图1可知，37℃培养24 h后，沙门氏菌在XLD培养基上的菌落形态为粉红色并带有黑色中心的菌落；经42℃培养48 h后，BS培养基上的菌落形态为黑色有金属光泽的菌落。

图1 分离纯化结果Fig.1 Separation and purification results

2.2 invA PCR鉴定结果（见图2）

由图2可知，使用PCR法对疑似分离株进行inv A特异性基因鉴定，有20株片段与预期大小一致，约284 bp。

图2 部分样品invA基因扩增鉴定结果Fig.2 PCR analysis of inv A gene in some samples

对上述产物进行测序并将结果在NCBI比对，结果显示，有16株与GenBank上沙门氏菌序列同源性达99%以上，确定为沙门氏菌。

2.3 沙门氏菌分离鉴定结果

对在屠宰场采集的112份样品，采用传统培养基培养和PCR鉴定相结合的方法，共分离鉴定得到16株沙门氏菌，总阳性率为14.29%（16/112）。

其中，羊酮体阳性率12.28%（7/57）、羊肠内容物阳性率13.33%（4/30）、操作环境拭子阳性率20.00%（5/25）。

2.4 沙门氏菌药敏试验结果（见表2）

由表2可知，16株菌株对氨苄西林（68.75%）、头孢噻肟（100.00%）和头孢曲松（100.00%）表现高度耐药；对氯霉素、四环素、诺氟沙星中介率较高，分别为62.50%、56.25%、56.25%；对氧氟沙星敏感率最高，但仅为37.50%。

表2 沙门氏菌药敏试验结果Tab.2 Salmonella susceptibility test results

3 讨论

由沙门氏菌引起的群体性食源性疾病愈发受到重视，已被世界卫生组织认定为最常见食源性疾病病源之一[12]。人与动物的直接接触可能在一定程度上促进耐药菌株在宿主之间的迅速传播，能够密切接触到耐药菌株的人相对存在更大程度上被感染的风险[13]。抗生素的使用是耐药基因传播的关键因素。在动物性食品产业链中，抗生素一直作为治疗剂、预防性药物以及生长促进剂普遍应用，在一定程度上加剧了耐药菌的传播[14]。

国家疾病预防控制中心在2001年对生肉等7大类中国食品致病菌的调查中发现，生肉中沙门氏菌的平均污染率为9.35%[15]。本试验对乌鲁木齐某羊屠宰场112份样品进行沙门氏菌检测，结果显示，16份样本显示阳性，检出率为14.29%。不同研究中沙门氏菌检出率的差异性，可能受调查对象不同、采样季节变化、屠宰卫生条件、运输销售、分离方法等因素影响。因此，乌鲁木齐市食源性沙门氏菌的污染情况不容忽视，应加强监督管理。

大量研究表明，肉制品产业链中存在耐药性细菌[16]，抗生素的使用是引起耐药菌出现的关键因素。因此，本研究对该屠宰场分离到的16株沙门氏菌进行11种抗生素的耐药性检测，结果显示，16株分离株均表现敏感，其中对β-内酰胺类表现为高度耐药，且对头孢噻肟、头孢曲松高达100%，可能是由于在养殖过程中β-内酰胺类药物主要用于预防治疗其他疾病有关。

羊源沙门氏菌通过食物链传播，耐药菌极易再传播，不仅影响畜牧业发展，还会威胁人类健康，抗生素类药物的规范使用迫在眉睫。故应当加强对耐药菌的监督和检测，以便积极应对沙门氏菌耐药性问题。