1例肉鸡J亚群禽白血病的病原学诊断

2022-10-27赵静温贵兰李涛张霞胡璇孙芸刘蔓蔓徐飞

现代畜牧兽医 2022年8期

赵静，温贵兰*，李涛，张霞，胡璇，孙芸，刘蔓蔓，徐飞

（1．贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025；2．贵州省动物生物制品工程技术研究中心，贵州贵阳 550016；3．贵州省动物疫病预防控制中心，贵州贵阳 550025）

禽白血病是由反转录病毒科，α-逆转录病毒属的禽白血病病毒（ALV）引起的一类以淋巴细胞瘤、髓细胞瘤、血管瘤和免疫抑制病为主的肿瘤性疾病[1]。ALV基因组主要包括gag、pol和env基因，其中gag和pol基因相对保守，env基因存在较大变异。pol基因中的P27基因是一段高度保守的基因，可编码ALV群特异性抗原，常被选为检测ALV的目的基因片段。

根据宿主的范围、病毒包膜的干扰和交叉中和模式，可将ALV分为A～K共11个亚群[2]。ALV包括外源性和内源性感染，其中以鸡为宿主的外源性ALV包括A、B、C、D、J、K等6种亚群，对鸡生产影响较为严重的是A、B和J亚群。ALV-J是一种逆转录病毒，在所有亚群中具有最强的致病性和传染性，主要诱导造血系统恶性肿瘤和髓性白血病[3]，占禽类白血病的90%以上[4]，可对全球养鸡业造成巨大经济损失[5]。1988年，ALV-J首次分离自英国的商业肉鸡，之后该病毒感染白羽肉鸡或亲代种鸡，在中国迅速传播。ALV-J的宿主范围逐渐扩大到肉鸡群、黄鸡群、野生鸟类和斗鸡，导致了病毒的显著遗传多样性[6]。2021年，贵州省某肉鸡养殖场出现肉鸡发病死亡，部分发病鸡主要表现为精神沉郁、消化不良、被毛杂乱无光泽，采食量下降，死前倒地抽搐。本研究对贵州某养殖场的发病鸡进行病理剖检、PCR检测，并对阳性条带进行测序比对，构建系统进化树，以期为相关研究与应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料来源

20只发病鸡来自贵州省某养殖场。

1.1.2 试剂与仪器

主要试剂：病毒核酸RNA提取试剂盒（哈尔滨元亨生物药业有限公司）；HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒、2×Es Taq Master Mix（康为世纪生物科技有限公司）；DL 2 000 Marker（宝生物工程（大连）有限公司）。

主要仪器：SYGENE凝胶成像仪（基因科技（上海）股份公司）、SW-CJ-2FD双人单面超净工作台（苏州净化设备有限公司）、多功能梯度PCR仪（成都锦世昌祥科技有限公司）、DYY-6D电泳仪（北京六一生物科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计（见表1）

参照参考文献[7]中的方法合成ALV通用型特异性引物ALV p27-F/R；参照参考文献[8-9]合成ALV-A、ALVB、ALV-K、ALV-J亚群特异性引物，上述引物均由上海生物工程股份有限公司合成。

1.2.2 剖检观察

剖检20只发病鸡，观察其内脏器官病变情况。

1.2.3 病毒基因组RNA提取

无菌采集发病肉鸡脾脏、肝脏、肾脏、心脏，按照病毒基因组RNA提取试剂盒说明书提取RNA，按照HiFi-Script cDNA合成试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA。以转录合成的cDNA为模板，进行PCR扩增。

反应体系（20 μL）：2×Es Taq DNA Mix 10μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、模板2 μL、ddH2O 7 μL。

反应条件：95℃预变性6 min；95℃变性30 s，退火（退火温度见表1）30 s，72℃延伸90 s，共30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 引物序列信息Tab.1 Primer sequence information

1.2.4 目的基因序列分析及遗传进化树的构建

将扩增目的条带切割并送至上海生工生物有限公司测序，采用DNA Star将所得序列与ALV参考株进行同源性分析，并构建系统进化树。参考毒株见表2。

表2 参考毒株Tab.2 Reference strains

2 结果与分析

2.1 发病鸡剖检结果（见图1）

由图1可知，部分病鸡剖检可见肝脏肿大、有白色肿瘤结节，肾脏肿大、有肿瘤性结节，脾脏肿大，气管出血。

图1 发病鸡剖检结果Fig.1 Necropsy result of sick chickens

2.2 ALV P27 PCR检测结果（见图2）

由图2可知，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，于744 bp出现目的条带，与预期结果相符。

图2 ALV P27 PCR检测结果Fig.2 PCR detection result of ALV P27

2.3 ALV亚群PCR鉴定结果（见图3）

由图3可知，使用ALV-J和ALV-A、ALV-B、ALV-K亚群特异性引物对核酸样本进行PCR扩增，结果显示，仅在422 bp处出现特异性扩增条带，表明此次发病鸡均为ALV-J感染。

图3 ALV亚群PCR鉴定结果Fig.3 PCR identification result of ALV subgroup

将目的条带送至上海生工生物有限公司进行测序。

2.4 GZGY2021株核苷酸序列相似性比对结果（见图4）

图4 GZGY2021核苷酸序列相似性比对结果Fig.4 Similarity comparison result of GZGY2021 nucleotide sequences

将测序所得序列命名为GZGY2021，并与GenBank数据库中的ALV参考毒株进行BLAST比对，利用DNA Star生物分析软件将GZGY2021株与GenBank上下载的15株毒株进行比较分析。

由图4可知，GZGY2021株与J亚群毒株序列相似性在92.0%～99.8%，J亚群毒株AHaq02（登录号：KF534753）与GZGY2021株序列相似性最高（99.8%），与A、B、C、D、E、K亚群的参考毒株序列相似性为47.8%～49.5%。

2.5 GZGY2021核苷酸序列遗传进化树构建（见图5）

由图5可知，GZGY2021与ALV-J亚群聚于一支，且与参考毒株AHaq02（登录号：KF534753）亲缘关系最近，与A、B、C、D、E、K亚群属不同分支，表明GZGY2021属于ALV-J亚群。

图5 ALV-J核苷酸序列遗传进化树Fig.5 Genetic evolution tree of ALV-J nucleotide sequence

3 讨论

ALV-J主要诱发鸡髓性白血病和血管瘤，可导致免疫抑制，常继发或并发多种其他疾病[10]。ALV-J引起的免疫抑制主要包括：病毒入侵引起法氏囊、胸腺等淋巴细胞的凋亡或坏死，导致T淋巴细胞和B淋巴细胞分化、成熟受阻；骨髓组织发生病变，导致T、B淋巴细胞减少；外周免疫器官发生病变，导致成熟淋巴细胞减少，体液、细胞及非特异性免疫水平下降[11]。ALV-J感染与内脏、血管肿瘤发病相关，并伴有发育迟缓、产蛋量减少和病死率提高等[12]。

目前尚未研制有效的药物和疫苗防治禽白血病，仍采取ALV监测和种源净化干预此病的传播。ALV主要通过垂直传播，但水平传播造成的影响不可小觑[13]，如种蛋孵化器消毒、孵化环节的控制及养殖场工作人员的管理等均是净化过程中的重要因素。《动物防疫法》明确将“净化消灭”纳入动物防疫的方针和要求[14]，我国于2008年开始陆续在种鸡场开展ALV净化工作，目前ALV已不再发生大范围流行。但我国地方鸡品种繁多，不同地区养殖水平差异较大，ALV仍在地方品种鸡场出现。本研究20份样本中检出12份ALV-J阳性病例，表明该场出现ALV-J感染，应及时淘汰感染鸡，建立完整的生物安全体系。

遗传进化分析可知，该肉鸡场的流行毒株与AHaq02毒株亲缘关系最近。AHaq02毒株分离自安徽省动物兽医科学研究所，该场出现ALV感染的原因也可能与该养殖场曾从安徽引种有关。为防控ALV可建立各功能区，加强生物安全屏障；强化各环节消毒，防止病毒传播；定期开展ALV监测和风险评估，及时淘汰阳性病例并做好相关消毒工作[15]；净化种群，坚持自繁自养，从源头消灭传染源[16]。随着禁抗政策实施及中草药应用于动物的研究不断发展，还可采用中草药防控ALV，如黄芪提取液可明显下调ALV-J中gp37基因的表达，郁金、益母草、土茯苓等对gp37基因的表达也具有一定影响，在日粮中添加上述中草药制成的添加剂可提高鸡群对ALV的抵抗力[17-18]。