D-101大孔吸附树脂纯化沙棘叶黄酮的特性研究

黄 莎，刘燕梅，昌 琴，杨 聆，苏紫艳，杨 娟

（宜宾市产品质量监督检验所，四川宜宾 644002）

沙棘属胡颓子科的一种果实，多年生落叶灌木或者小乔木[1]，具有抵御干旱、抵抗寒冷的特性，且生态适应能力较强[2-3]。因富含大量维生素，被称为“天然维生素宝库”。沙棘富含多种生理活性物质和营养成分，黄酮类化合物为主要生物活性物质，具有清除自由基、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒和调节免疫等功能[4-7]。大孔吸附树脂具有多孔网状结构和良好的吸附性能，可用于提取分离水溶性成分[8]。汤如莹[9]等用D101型大孔吸附树脂探究分离纯化沙苑子总黄酮的工艺。本项目通过探究大孔吸附树脂的特性并得出沙棘黄酮纯化的最优工艺，为后续工业化生产提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

芦丁标准品（≥95%）（成都瑞芬思生物科技有限公司）；95%乙醇、亚硝酸盐、硝酸铝、硝酸钠、氢氧化钠（成都领江化工厂）；D-101大孔吸附树脂（西安蓝晓科技有限公司）；沙棘叶。

1.2 仪器与设备

超声波粉碎机（广东市旭明有限责任公司）；电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣市生化仪器厂）；真空抽滤机（巩义市予华仪器有限公司）；电热鼓风干燥箱（上海琅玕实验有限责任公司）；紫外可见分光光度计（上海分析仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 实验步骤

沙棘黄酮浸膏的制备→D-101大孔树脂预处理及装柱→原液混匀装柱→对照品的配制。

1.3.2 沙棘叶黄酮的测定方法

采用外标法，称量芦丁3 mL于25 mL的比色管中，加60%的乙醇定容到3 mL，依次加入5%亚硝酸钠，10%硝酸铝，各1 mL，分别摇匀静置6 min，再加入10%氢氧化钠，用30%乙醇定容到25 mL，摇匀静置15 min在500 nm波长处测定吸光度（除空白不加氢氧化钠外，其他都要加）。

1.3.3 静态吸附

将活化后的大孔吸附树脂2 g（湿重）加30 mL的样液，振荡2 h并放置24 h，过滤并测定吸光度，计算静态吸附量、吸附率。向吸附后的树脂中加入95%的乙醇80 mL，振荡2 h并静置24 h，测定解吸液的吸光度。计算静态解吸量、解吸率。

1.3.4 泄漏曲线

称取12.5 g 20 mL活化后的D-101大孔树脂装柱，以沙棘浸膏质量0.01 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1的上样浓度，速度1 BV·h-1（BV为20 mL），采样80 mL，且每0.5 BV收集1管，收集8管，测定质量浓度，绘制泄漏曲线。

1.3.5 动态吸附行为考察

称取12.5 g 20 mL活化后的D-101大孔树脂装柱，以1 BV·h-1的速度进样20 mL 0.04 g·mL-1浸膏，再以4 BV蒸馏水，1 BV·h-1的流速冲洗填柱，每隔0.5 BV收集冲洗液（同时记录消耗时间），测定其中的黄酮含量（同时测量冲洗液体积并记录）。以柱体积（BV）为横坐标，黄酮含量为纵坐标绘制动态吸附曲线。

1.3.6 洗脱剂与洗脱体积的选择

采 用 不 同 浓 度 的 乙 醇（10%、30%、50%、70%、）各100 mL（5 BV），流速为1 BV·h-1冲洗，填柱，且每隔0.5 BV收集冲洗液（同时记录消耗时间），测定其中的黄酮含量（同时测量冲洗液体积并记录）。

1.3.7 计算公式

（1）纯化物总黄酮含量的计算。公式为

式中：m1—纯化物总黄酮含量，g/100 g；m—由外标算得被测液中黄酮量，mg；V1—测定用试样体积，mL；V2—试样定容总体积，mL。

（2）吸附量、吸附率、解吸量和解吸率的计算。公式依次为

式中：ρ1—上样液中总黄酮的质量浓度，mg·g-1；ρ2—水洗液中总黄酮的质量浓度，mg·g-1；ρ3—醇洗液中总黄酮的质量浓度，mg·g-1；V1—上样液的体积，mL；V2—水洗液的体积，mL；V3—醇洗液的体积，mL；M—树脂的质量，g。

2 结果与分析

2.1 静态吸附黄酮结果

上样浸膏黄酮的含量为（4.23±0.07）mg·mL-1，其结果如下（见表1）。

表1 静态吸附黄酮吸附量、吸附率、解吸量、解吸率

2.2 动态吸附泄漏曲线

由图1～图3可得，不同浓度的浸膏含量对泄漏曲线的影响较大；随浓度增大，泄漏点体积呈逐渐减小且趋于平稳趋势。浸膏浓度0.01 g·mL-1时，在0.5～3.5 BV时，所测得的黄酮含量增幅较小，在4 BV时，黄酮含量峰面积明显增大，黄酮此时发生泄漏，4 BV为其泄漏点。浸膏含量为0.02 g·mL-1时，在0.5～1.0 BV时，所测得的黄酮值偏小且稳定。在1.5 BV时，黄酮含量峰面积明显增大，黄酮此时发生泄漏。浸膏含量为0.04 g·mL-1，在0.5～1.0 BV时，黄酮含量呈增大趋势，但随样液体积增大，在1.5 BV时，峰面积明显增大，1.5 BV为其泄漏点。此后，随样液体积增大，黄酮含量缓慢增加。以相同流速上样时泄漏点越低，说明树脂对黄酮的吸附能力越好，从效率角度出发，浓度越大黄酮的吸附效果更好，故选取0.04 g·mL-1浸膏为上样的最佳浓度。

图1 0.01 g·mL-1浸膏泄漏曲线

图2 0.02 g·mL-1浸膏泄漏曲线

图3 0.04 g·mL-1浸膏泄漏曲线图

2.3 水洗除杂动态洗脱曲线

取0.04 g·mL-1的浸膏浓度，黄酮的浓度为（5.60±0.07）mg·mL-1，取样体积为0.1 mL。由图4可知，黄酮吸附量随着水洗液体积的变化呈先降低后升高并趋于稳定，其中水洗体积在1 BV时黄酮和大量的杂质被水洗液水洗出，吸附量最低；当水洗体积达到3 BV后，水洗液中黄酮含量不再增大，此时大孔吸附树脂所吸附的黄酮含量趋于稳定，故选取3 BV为最佳水洗体积。

图4 0.04 mg·mL-1浸膏动态洗脱曲线

2.4 洗脱剂浓度的选择和醇洗脱体积选择

由图5可知，随着浓度的增大，解吸的峰值呈先增大后减小趋势，根据所测黄酮峰值大小，综合考虑成本，可选择50%和70%醇洗脱剂，不同浓度的乙醇溶液在醇洗液体积为3 BV时所测含量趋于稳定，大孔吸附树脂中的黄酮绝大多数被洗脱出来，因此3 BV为最佳的解吸体积。

图5 不同乙醇浓度对黄酮吸附的影响

2.5 醇洗脱浓度和体积的确定

由图6可知，随着浓度的增加，被解吸的黄酮总量呈先增加后下降趋势，浓度为50%时为最高值。洗脱液3 BV与5 BV条件下，黄酮解吸含量差异较小，为考虑工艺成本可选择3 BV的洗脱体积。

图6 不同浓度乙醇洗脱液中的黄酮总量比较

2.6 动态吸附黄酮验证实验

采 用0.04 g·mL-1浸 膏， 黄 酮 含 量 在（5.67±0.27）mg·mL-1，上样体积1 BV，水洗体积3 BV、水洗速度1 BV·h-1，醇洗浓度50%、体积3 BV，速度1 BV·h-1。其结果如表2所示。

表2 动态吸附黄酮吸附量、吸附率、解吸量、解吸率

3 结论

大孔吸附树脂可分为静态吸附和动态吸附两种方式，其型号根据其孔径颗粒的大小及其吸附的范德华力的不同，分为不同的种类和型号，在国内有9AB-8、ADs-8[10-11]等类型。本项目通过研究D-101大孔吸附树脂对沙棘黄酮的吸附情况，得出了动态吸附方式优于静态吸附。当上样浓度为0.04 mg·mL-1浸膏、上样体积1 BV、水洗体积3 BV、醇浓度50%、醇洗体积3 BV、上样流速1 BV·h-1、洗脱流速1 BV·h-1，此工艺下动态吸附量为8.04 mg·g-1，吸附率为87.04%，解吸量为8.18 mg·g-1，解吸率为92.00%。因此，后续相关研究中可采用不同型号大孔树脂对黄酮的吸附情况进行研究，以期得到更好的工艺条件，并运用于工业化生产中。