特殊医学用途配方食品中含硫氨基酸测定方法的研究

梅端果，方 芳，蒲小春

（1.爱优诺营养品有限公司，江西九江 332000；2.美庐生物科技股份有限公司，江西九江 332000）

特殊医学用途配方食品是一种医用食品，主要应用于术后恢复期、消化吸收障碍或患有特定疾病的人群，其在减少感染、纠正代谢失衡、增强各种治疗手段的效果、促进康复等方面具有重要意义[1-3]。氨基酸作为人体所必需的营养物质，氨基酸的测定对于食品营养成分的评价具有重要意义。食物中含硫氨基酸的含量是蛋白质质量评价的重要指标，也是食品氨基酸模式的重要评价因素[4-6]。研究表明，含硫氨基酸具有防止褐变、调节风味、改善质地等食品感官作用，同时在生理调节功能方面有抗氧化、拮抗化学致癌物和解除蛋白酶抑制剂等功效[7]。因此，在特医食品领域对含硫氨基酸的准确测定具有重大意义。

目前，针对含硫氨基酸在常规水解中的不稳定性和易氧化性，国内外学者为能准确测定含硫氨基酸进行了大量的研究。于淑新等[8]采用高效液相色谱法测定饲料中的含硫氨基酸；蒲云月[9]采用氨基酸分析仪法测定奶粉中的含硫氨基酸；杨元秀等[10]采用氨基酸分析仪测定饲料及其原料中的含硫氨基酸；熊南安等[11]采用反向高效液相色谱法检测污泥中含硫氨基酸。本文建立了一种采用氧化水解的样品处理方法并用全自动氨基酸分析仪分析含硫氨基酸的检测方法，该方法简便、高效、准确，能有效地减少胱氨酸和蛋氨酸的损耗，适用特殊医学用途配方食品中含硫氨基酸的测定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：特殊医学用途蛋白组件配方食品；麦芽糊精。

试剂：L-磺基丙氨酸标准品（BePure，纯度99.3%）；L-蛋氨酸砜标准品（美国sigma公司，纯度100%）；30%双氧水（光华科技，AR）；盐酸（西陇科学，GR）；甲酸（光华科技，AR）；苯酚（西陇科学，AR）；氢氧化钠（光华科技，AR）；偏重亚硫酸钠（上海展云，AR）；日立茚三酮溶液；氨基酸分析仪PH系统缓冲液（KANTO）；一级水。

1.2 仪器设备

LA-8080高速氨基酸分析仪（日立）：茚三酮柱后衍生离子交换色谱仪及570 nm和440 nm光度检测器；SQP分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司，感量0.01 mg）；BSA224S分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司，感量0.1 mg）；PHS-3C雷磁PH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；QYYS-10A纯水仪（重庆前沿水处理设备有限公司）；101-3A电热鼓风恒温箱（上海锦屏）。

1.3 实验方法

1.3.1 方法原理

样品中的含硫氨基酸用过甲酸氧化和盐酸溶液水解生成磺基丙氨酸和蛋氨酸砜，经离子交换色谱法分离，茚三酮柱后衍生，分光光度法检测，外标法定量。

1.3.2 色谱条件

脱氨柱：4.6 mm×60 mm（填料#2622SC）（P/N 855-4506）；pH系统分析柱：4.6×40 mm（填料#2650L）（P/N 855-3523）；检测波长：570 nm和440 nm；进样量：20 µL；梯度洗脱及程序设定见表1。

表1 梯度洗脱及程序

1.3.3 标准溶液的配制

（1）磺基丙氨酸-蛋氨酸砜标准贮备液配制。准确称取磺基丙氨酸105.7 mg和蛋氨酸砜113.3 mg，加水溶解并定容至250 mL，浓度均为2.50 µmol·mL-1。

（2）混合氨基酸标准工作液配制。吸取磺基丙氨酸-蛋氨酸砜标准贮备液1.00 mL置于50 mL容量瓶中，以0.02 mol·L-1盐酸定容至刻度，混匀。磺基丙氨酸及蛋氨酸砜浓度均为50 nmol·mL-1。

1.3.4 样品前处理

称取试样50～75 mg（约含蛋白质7.5～25.0 mg，精确至0.1 mg），置于20 mL试管中，于冰水浴中冷却30 min后加入已冷却的过甲酸溶液（将过氧化氢+甲酸=1+9，混合，并按每毫升添加5 mg比例加入苯酚，于室温放置1 h，置冰水浴中冷却30 min，临用现配）2 mL，加液时需将样品全部润湿，但不要摇动，盖好瓶塞，连同冰浴一同置于0～4 ℃冰箱中，反应16 h，实验做2个平行。

向反应液中加入偏重亚硫酸钠溶液0.5 mL，充分混匀后，直接加入盐酸溶液17.5 mL置于110 ℃±2 ℃恒温箱中水解，水解22～24 h。（注意：在水解开始时，不要封安瓿瓶瓶口，或旋动水解管的管帽，待水解1 h后再封口或旋紧管帽，否则容易引起水解管爆裂）。取出安瓿瓶或水解管，冷却，用水将内容物转移至50 mL容量瓶中，用氢氧化钠溶液中和至pH约2.2，并稀释上机用0.02 mol·L-1盐酸定容，离心，取上清液供仪器测定用。

2 结果与分析

2.1 特征峰的选择

将浓度为2.5 µmol·mL-1的磺基丙氨酸及蛋氨酸砜标准溶液分别进样分析，同时将浓度为50 nmol·mL-1磺基丙氨酸-蛋氨酸砜混合标准溶液进样分析，进行峰定位。磺基丙氨酸及蛋氨酸砜标准品色谱图见图1～图3。

图1 磺基丙氨酸色谱图

图2 蛋氨酸砜色谱图

图3 50 nmol·mL-1磺基丙氨酸-蛋氨酸砜混合标准溶液色谱图

2.2 线性范围及检出限

按1.3.3步骤配制浓度分别为0 nmol·mL-1、10 nmol·mL-1、20 nmol·mL-1、50 nmol·mL-1、100 nmol·mL-1和200 nmol·mL-1的磺基丙氨酸-蛋氨酸砜混合标准溶液，并进样分析，以磺基丙氨酸（蛋氨酸砜）的浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。以3倍信噪比对应的目标物含量为该化合物的检出限，以10倍信噪比对应的目标物含量为该化合物的定量限。磺基丙氨酸和蛋氨酸砜的线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限见表2。由表2可知，磺基丙氨酸和蛋氨酸砜都具有很好的线性关系，相关系数r值均大于0.999。

表2 磺基丙氨酸和蛋氨酸砜的线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限

2.3 重复性与回收率

向本底中分别添加1 µmol、2 µmol和4 µmol的磺基丙氨酸和蛋氨酸砜标准物质，平行做6组，按1.3.4处理样品并分析。由表3可知，磺基丙氨酸和蛋氨酸砜的回收率在95.2%～100.6%，RSD在1.1%～2.0%。该方法回收率较高，相对标准偏差较小，重复性较好以及适用性较好。

表3 重复性实验结果

2.4 正确度

选用特殊医学用途蛋白组件配方食品测定含硫氨基酸，同时送第三方机构SGS进行检测，检测结果见表4。由表4可知，本中心与SGS的检测偏差均小于10%，其方法正确度较好。

表4 正确度检测结果汇总

3 结论

本文阐述了特殊医学用途配方食品中含硫氨基酸的测定方法，采用氧化水解的前处理方法，极大地减少了含硫氨基酸的损耗，并用全自动氨基酸分析仪进行分析，既简便又快捷。本文建立的含硫氨基酸测定方法线性良好、方法回收率高、精密度好以及正确度较好，能高效、准确地检测特殊医学用途配方食品中含硫氨基酸，使检测值更接近真实值。