超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡肉中万古霉素残留量

裴 娜，陈修红

（1.国贸食品科学研究院有限公司，北京 102209；2.国家副食品质量检验检测中心，北京 102209）

万古霉素是由链霉菌产生的结构复杂的三环糖肽类抗生素，因具有阻断细胞壁的合成、改变细胞膜的通透性和阻碍细菌RNA的合成等三重作用机制，对多数革兰阳性菌具有强大的杀菌作用，可用于治疗多数革兰阳性菌引起的感染[1-3]。万古霉素能够减少细菌毒素对动物生长的抑制，经食物链进入人体后，会逐渐在体内蓄积而导致各种器官发生病变，如视听神经受损、肝肾脏发生病变等，因此需要严加重视。欧盟在2006年1月，为保障食品安全，全面禁止在饲料中添加任何抗生素；美国从1997年起禁止在畜禽养殖中使用万古霉素。日本规定牛奶中万古霉素的限量值为10 μg·kg-1。我国农业部公告第560号规定万古霉素为禁用兽药。可靠的残留检测方法是进行农产品抽检和市场监管的基础和前提，但是目前万古霉素测定的方法相对较少，标准适用性较窄，且提供的方法实际操作过程相对复杂，稳定性差。基于此，本文拟建立鸡肉中万古霉素的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱（Ultra-high Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）检测方法，以求更好地为食品安全提供保障。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters Xevo TQ-S超高效液相色谱-串联质谱仪（美国Waters公司）；Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm，美国Waters公司）等；Allegra 64R 高速冷冻离心机（美国贝克曼公司）；水浴氮吹仪：NEVAP24型（美国Organomation）；Oasis MCX固相萃取柱（美国waters公司）；电子SSA224-CW天平（感量0.000 1g，美国Sartorius公司）。

盐酸万古霉素标准品（CAS号1404-93-9，纯度≥96.5%，英国LGC公司）；甲醇、甲酸、乙腈：色谱纯（国药集团化学试剂有限公司）；氨水、盐酸、正己烷：分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；试验用水：一级水（美国Mill-pore-Q超纯水仪制得）。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制

标准储备溶液：准确称取盐酸万古霉素标准品约10.3 mg（精确至0.1 mg），用少量超纯水溶解，并定容至10.0 mL容量瓶中，制得约1 mg·mL-1万古霉素标准储备溶液。于-20 ℃条件下保存，有效期3个月。

标准中间液：准确吸取适量上述标准储备液，用超纯水稀释成浓度为10 μg·mL-1标准中间液，于2～8 ℃条件下保存，有效期1周。

标准系列溶液：取900 μL超纯水，加入标准中间液（10 μg·mL-1）100 μL，涡旋混匀，配制出1 μg·mL-1的工作液；再分别吸取1 000 μL、980 μL、960 μL、940 μL、920 μL和900 μL空白基质液，加入1 μg·mL-1的 工 作 液0 μL、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL和100 μL，涡旋混匀，得到浓度为0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1、40.0 ng·mL-1、60.0 ng·mL-1、80.0 ng·mL-1和100.0 ng·mL-1的基质曲线。

1.2.2 样品前处理

提取：精密称取5.0 g（精确到0.001 g）鸡肉样品于具塞离心管中，加入20 mL 0.1%甲酸-乙腈（70∶30，V/V）溶液，加盖涡旋混匀1 min，超声提取10 min，于4 ℃、9 500 r·min-1离心5 min，取上清液10 mL，加入10 mL乙腈饱和的正己烷，涡旋混匀，于4 ℃、9 500 r·min-1离心5 min，弃去上层，保留下层清液待净化。

净化：取上述下层清液5 mL，上样前预先用5 mL甲醇、5 mL 0.1 mol·L-1盐酸活化Oasis MCX固相萃取柱（60 mg/3 mL），取全部待净化液加入活化后的固相萃取柱，上样速度为1 mL·min-1，然后用5 mL 甲醇淋洗，淋洗后抽干1 min，用5 mL甲醇-氨水（95∶5，V/V）洗脱，收集全部洗脱液，于40 ℃氮吹至近干，用1.0 mL 0.1%甲酸水溶液复溶，过0.22 μm滤膜，待测。

基质匹配曲线：准确移取万古霉素标准溶液适量，用空白样品基质稀释定容，分别制得不同浓度的基质匹配标准溶液，绘制基质匹配标准曲线（图1）。

图1 基质标准曲线

1.2.3 仪器条件

（1）色谱分析条件。Waters Acquity BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流动相：A相为乙腈，B相为含0.1% 甲酸水溶液；流速：0.3 mL·min-1；进样体积：2 μL；柱温：30 ℃；梯度洗脱程序：0～0.5 min，5% A；0.5～1.7 min，5%→40% A；1.7～2.5 min，40%→90% A；2.5～3.5 min，90%→5% A；3.5～4.5 min，5% A。

（2）质谱分析条件。离子源：电喷雾电离ESI（+）；源温度：150 ℃；离子喷雾电压：3.5 kV；脱溶剂温度：500 ℃；脱溶剂气（N2，纯度99.999%）；流速：1 000 L·h-1；锥孔气（N2，纯度99.9%）；流速：30 L·h-1；碰撞气：氩气，纯度99.999%；采用多反应监测模式进行检测，具体的监测离子与MS参数见表1。

表1 万古霉素多反应监测离子对及MS参数

2 结果与分析

2.1 前处理方法优化

万古霉素分子中含有多个羟基，故在水溶液的溶解度很好，微溶于甲醇等有机溶剂[4-6]。本文考察了不同SPE固相萃取柱的回收率和不同溶剂的提取效率。实验采用5 mL水溶解的50 ng·mL-1万古霉素标准溶液直接过预活化的固相萃取小柱的方式考察不同萃取柱的回收情况。结果显示，SCX、MCX、HLB 3种不同SPE小柱对万古霉素回收率分别为62.30%、80.20%、47.60%，混合阳离子交换MCX小柱回收率最高，如表2所示。进一步考察了3%、5%、8%氨化甲醇对MCX柱的洗脱能力，发现5%氨化甲醇效果最好，回收率达88.28%，具体结果如表3所示。

表2 固相萃取柱回收率

表3 不同浓度洗脱液对MCX柱的回收率

2.2 回收率和精密度

选择空白鸡肉样品，按本实验优化的方法进行灵敏度、回收率和精密度的测定，在2.0 μg·kg-1、4.0 μg·kg-1、20.0 μg·kg-13个 浓 度 水 平 加 标，每水平6次平行，计算回收率和相对标准偏差。结果见表4。由此可知，万古霉素的平均回收率在61.1%～68.3%，精密度RSD在1.77%～3.36%。同时由表5可见在2～100 ng·mL-1目标物线性关系良好，相关系数＞0.999，方法检出限（S/N=3）为0.43 μg·kg-1，定 量 限（S/N=10）为1.17 μg·kg-1。结果表明，本方法能够快速、准确、灵敏地测定鸡肉中的万古霉素残留量。

表4 回收率和精密度

表5 鸡肉中万古霉素的线性范围、回归方程、相关系数检出限和定量限

2.3 实际样品的测定

为了验证实验方法的适用性，选取本地市售20份鸡肉样品，对其中万古霉素含量进行测定，结果显示均为阴性，个别样品结果值0.5～0.9 μg·kg-1，均在定量限以下，可安全食用。

3 结论

本研究建立了鸡肉样品中万古霉素的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）检测方法，通过选择比较不同阳离子固相萃取柱净化以及不同浓度的洗脱液等一系列前处理步骤进一步减少了杂质干扰，同时还对比考察了更优的色谱及质谱条件，有效提高了检测的灵敏度和准确度。方法平均回收率介于61.1%～68.3%，精密度RSD在1.77%～3.36%。该方法前处理简单、分析时间短、重复性好，能够快速、准确、灵敏地测定鸡肉中的万古霉素残留量，满足日常监测需求。