加热过程中虾头蛋白变性程度的表征方法比较
2022-10-27刘秋梅王泽富刘振洋孙钦秀夏秋瑜韩宗元吉宏武施文正刘书成
刘秋梅,王泽富,刘振洋,孙钦秀, ,魏 帅,夏秋瑜,韩宗元,吉宏武,2,施文正,刘书成,2,
(1.广东海洋大学食品科技学院,广东省水产品加工与安全重点实验室,广东省海洋生物制品工程重点实验室,广东省海洋食品工程技术研发中心,水产品深加工广东普通高等学校重点实验室,广东湛江 524088;2.大连工业大学海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心,辽宁大连 116034;3.上海海洋大学食品学院,上海 201306)
凡纳滨对虾(),又称南美白对虾,是世界上最重要的经济虾类之一,多年来中国养殖产量居世界首位。凡纳滨对虾的加工主要以去头或去壳后冷冻为主,在加工过程中会产生40%~50%的副产物(虾头、虾壳和虾尾);虾头又是凡纳滨对虾加工副产物的主要组成部分,占副产物的70%~80%。
蛋白质是虾头中含量最多的营养成分,约占虾头的12%~18%。在食品工业中,常采用生物酶解法利用虾头蛋白质开发生物活性肽和虾类调味品(虾酱、虾粉、虾呈味基料)等,但在酶解过程中存在水解度低和蛋白质利用率低的问题。在实际生产中,通常选择特异性的蛋白酶和优化酶解条件来提高水解度和蛋白质利用率,然而改变酶解底物蛋白质结构也是提高水解度和蛋白质利用率的重要途径之一。已有研究表明:蛋白质在酶解处理之前进行预处理适度变性,促使蛋白质肽链逐渐伸展,能够暴露出更多的酶切位点,从而增加水解度和提高蛋白质利用率。热处理是诱导蛋白质变性常用的处理方法。适度热处理,蛋白质发生适度变性有利于酶解反应;过度热处理,蛋白质过度变性反而会抑制酶解反应。但是,如何表征蛋白质的变性程度以及蛋白质变性到什么程度最适于酶解反应,目前还尚不明晰。因此,探索蛋白质变性程度的定性和定量表征,有助于阐明蛋白变性程度对蛋白酶解特性影响的机理。为了获得高水解度、高蛋白质利用率的虾头酶解产品,可以通过控制加热过程以防止过度变性和质量劣化。
由于不同来源蛋白质的理化特性和分子结构有较大差异,蛋白变性情况也会存在较大差异。国内外蛋白质变性程度方法的研究:一是测定蛋白质的理化特性如溶解度和热力学特性等;二是测定分子结构包括二级结构和三级结构等;三是建立蛋白变性模型以预测蛋白的变性程度。这些方法主要是定性地分析不同预处理后蛋白的变化趋势,但直观定量表征蛋白质具体变性程度的研究较少。本研究以虾头中提取的混合蛋白为材料,在100 ℃加热一定时间,分析蛋白质溶解度、SDS-PAGE、圆二色谱和荧光光谱特征的变化,创新性地选择部分特征数据指标对蛋白质变性程度进行定性和定量表征,探索适合于表征虾头蛋白质变性程度的快速直观方法,为合理控制酶解过程、提高水解度和蛋白质利用率提供技术参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
鲜活凡纳滨对虾,规格50~60尾/kg 湛江霞山水产批发市场,利用海水充氧活运至实验室;考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒 北京索莱宝科技有限公司;考马斯亮蓝染色液、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)预制胶、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)、磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer solution,10×PBS,pH7.4) 上海碧云天生物技术有限公司;本实验所用试剂均为分析纯。
Chirascan V100圆二色光谱仪 英国Applied Photophysics公司;Varioskan Flash型全自动酶标仪
美国Thermo Fisher Scientific公司;RF-5301PC型荧光色谱仪 日本岛津公司;DYY-11型电泳仪 北京市六一仪器厂;JYL-C022绞肉机 山东九阳股份有限公司;FDU551型冷冻干燥机 日本东京理化器械株式会社;JXH-200恒温混匀仪 上海净信实业有限公司;Sigma3-30KS台式高速冷冻离心机 德国sigma离心机有限公司;VOPADEST450型全自动凯式定氮仪 中国广州德资格哈特仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 虾头粗蛋白的提取 凡纳滨对虾头粗蛋白的提取参考邵虎明的方法并略作改动。在冰水中将凡纳滨对虾头沿头胸甲末端取下,控干水分,于4 ℃冰箱贮藏待用。取适量虾头用绞肉机绞碎(每绞15 s暂停10 s,防止温度过高使蛋白变性)。取100 g绞碎虾头,按质量体积比1:6加入0.1 mol/L pH7.4 PBS,在冰水浴中磁力搅拌 6 h,离心 20 min(4 ℃,10000 r/min)。将离心后的沉淀按质量体积比1:4重新溶于PBS溶液,搅拌4 h后再次离心,合并两次上清液,用纱布过滤除去杂质得到虾头粗蛋白溶液。将虾头粗蛋白溶液直接冷冻干燥成蛋白粉于-20 ℃保存备用。
1.2.2 虾头蛋白热处理
1.2.2.1 虾头粗蛋白浓度 凯式定氮法测定鲜虾头粗蛋白为16 g/100 g,提取的虾头粗蛋白溶液浓度约为12 g/100 g,其余为基质蛋白和非蛋白氮。因此,虾头粗蛋白含量以12 g/100 g计(折算为约120 mg/mL)。在虾头酶解开发活性肽或呈味基料时,通常按照料液质量体积比(1:1、1:2、1:3)加水进行酶解处理,加水后粗蛋白浓度分别约为60、40、30 mg/mL。为了与实际生产相一致,称取虾头蛋白粉,加入适量蒸馏水复溶,分别配制成蛋白含量为60、40、30 mg/mL的虾头粗蛋白溶液。
1.2.2.2 热处理方法 取虾头粗蛋白溶液2 mL于试管中,置于100 ℃恒温混匀仪分别加热1、2、3、4、5、6、7、8 min后立即放入碎冰中冷却平衡。将热处理后的虾头粗蛋白溶液冷冻离心15 min(4 ℃,10000 r/min),取上清液用于测试蛋白质的溶解度、SDS-PAGE、圆二色谱和荧光光谱。以未加热处理的虾头粗蛋白溶液作为对照组。
1.2.3 溶解度测定 参考刘书成等的方法。用考马斯亮蓝法测热处理后经冷冻离心上清液中的蛋白质浓度,蛋白溶解度用公式(1)计算:
式中: ρ为离心前虾头蛋白质浓度(mg/mL);ρ为离心后上清液中蛋白质浓度(mg/mL)。
由图1A结果,定义未经加热处理的虾头蛋白为未变性状态,蛋白溶解度为S;在100 ℃加热4 min时(溶解度无显著变化)为完全变性状态,蛋白溶解度为 S;100 ℃加热 0~4 min的虾头蛋白溶解度为S。用公式(2)表征虾头蛋白的变性程度Δ:
1.2.4 SDS-PAGE电泳分析 将1.2.2加热处理后的蛋白质溶液稀释至1 mg/mL。取10 μL SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)和40 μL样品混匀后沸水浴加热 5 min,即为电泳样品,上样量为 15 μL。SDSPAGE:分离胶浓度12%,浓缩胶浓度4%,电极缓冲液(pH8.9)。电泳结束后,胶片用考马斯亮蓝染色液染色 90 min,再用脱色液(醋酸:无水乙醇:水=1:4:5)脱至条带清晰。用10~180 kDa的分子量标记校准观察,分析胶片中蛋白质条带变化。
灰度分析:将凝胶成像的电泳图,用Image J软件进行灰度分析。蛋白质电泳条带的相对灰度用公式(3)计算:
式中:A为未加热处理蛋白质电泳条带的灰度值;B为加热处理后蛋白质电泳条带的灰度值。
1.2.5 圆二色谱(Circular dichroism,CD)分析 采用Chirascan V100圆二色光谱仪进行二级结构分析。用去离子水将蛋白质溶液的浓度调节至0.04 mg/mL,置于0.05 cm光径的石英样品池中,以100 nm/min在远紫外区(190~260 nm)进行扫描,测蛋白质的椭圆率。
1.2.6 内源荧光光谱测定 参考Sun等的方法并略作修改。用去离子水将蛋白质溶液的浓度调节至0.04 mg/mL,用RF-5301PC型荧光色谱仪进行扫描,激发波长280 nm,扫描范围300~450 nm,狭缝宽度为5 nm。
1.3 数据处理
试验重复3批次,每批次3个平行处理,数据以平均值±标准差表示。采用JMP统计软件进行单因素方差和Tukey HSD多重比较分析,以95%置信水平确定差异显著性;用Image J分析SDS-PAGE电泳条带灰度;用Origin 2021软件作图。
2 结果与分析
2.1 虾头蛋白溶解度与变性程度
溶解度在一定程度上可以代表总可溶性蛋白含量,也是蛋白质变性程度的一个重要表征指标。图1A是不同浓度虾头蛋白在加热过程中的溶解度变化。加热前4 min,随着加热时间延长,虾头蛋白的溶解度逐渐下降。因为加热使蛋白质肽链展开,包埋在蛋白质内部的疏水性基团暴露,亲水性基团相对减少,蛋白质疏水性增加,导致部分蛋白质发生聚集沉淀,使蛋白溶解度降低。也有研究发现在热处理过程中蛋白质容易发生氧化,使蛋白质交联增加,导致蛋白质溶解度降低。与未加热虾头蛋白相比,加热处理4 min时,虾头蛋白溶解度降低了约90%;在加热时间4 min后,再延长加热时间,虾头蛋白的溶解度不再有显著变化(>0.05)。这主要是由于虾头的可溶性蛋白在加热过程中逐渐变性沉淀,在加热到4 min时可溶性蛋白变性沉淀达到最大值。罗嫚利用SDS-PAGE电泳图谱得出猪肉蛋白经过75 ℃水浴加热3~5 min时接近完全变性,与本研究结果相似。
图1 加热过程中虾头蛋白溶解度(A)和变性程度(B)的变化Fig.1 Changes in the solubility (A) and denaturation degree (B)of shrimp head protein during heating
以溶解度表征虾头蛋白的变性程度,按照公式(2)计算,结果见图1B。在加热0~4 min时,随着加热时间增加,虾头蛋白的变性程度显著增加(<0.05),在4 min时变性程度达到最大值;在加热4 min以后,虾头蛋白的变性程度不再显著增加且趋于平稳(0.05),这说明虾头蛋白在加热4 min时已达到完全变性。
2.2 虾头蛋白SDS-PAGE电泳与变性程度
图2中A、B和C分别为60、40、30 mg/mL虾头蛋白热处理后的SDS-PAGE电泳图谱。由图2A、2B和2C可知,虾头蛋白的分子质量分布在25~100 kDa,但主要集中在75 kDa附近。这说明75 kDa附近的蛋白质是虾头的主要蛋白,记75 kDa附近的电泳条带区域为AB带。由图2A、2B和2C可知,随着加热时间的增加,三种浓度虾头蛋白的电泳图谱中AB带的灰度均逐渐变浅,尤其在4 min后,AB带的灰度不再有明显变化。这说明AB带的蛋白质在加热过程中逐渐变性,在加热4 min时达到完全变性。加热处理会使蛋白质变性聚集而沉淀,变性蛋白留在沉淀中,而电泳样品是加热处理后离心的上清液,因此变性蛋白的电泳条带灰度会随变性程度的增加而逐渐变浅,甚至消失。在本实验的加热过程中,AB带的灰度变化最明显,因此可用AB带来指示虾头蛋白加热过程中的变性程度。
由图2A、2B和2C可知,加热过程中蛋白质在SDS-PAGE图谱中分子量约75 kDa附近的电泳条带变化最明显,将该区域条带表示为AB。定义未经加热处理的虾头蛋白为未变性状态,AB条带的相对灰度值为AB;在100 ℃加热4 min时(AB条带完全消失)为完全变性状态,AB条带的相对灰度值为AB;100 ℃加热0~4 min的虾头蛋白AB条带相对灰度值为AB。用公式(4)表征虾头蛋白的变性程度 ΔSDS-PAGE:
以AB带相对灰度值变化表征虾头蛋白的变性程度,按照公式(4)计算,结果见图2D。同一浓度下,在加热1 min时,虾头蛋白变性程度出现负值,这是因为初始加热使部分小分子蛋白(小于75 kDa)发生聚集生成了约75 kDa的聚集体,从而使AB带相对灰度值增加。加热1~4 min时,虾头蛋白的变性程度显著上升(<0.05),在4 min时变性程度达到最大值,这是因为持续加热使蛋白质变性聚集而沉淀。加热4 min后,虾头蛋白的变性程度在最大值趋于平稳(>0.05)。这也说明虾头蛋白在加热4 min时已达到完全变性。
图2 加热过程中虾头蛋白的SDS-PAGE图谱和变性程度的变化Fig.2 Changes in the SDS-PAGE and denaturation degree of shrimp head protein during heating
2.3 虾头蛋白圆二色谱与变性程度
圆二色光谱常用来表征蛋白质的二级结构,紫外区段(190~240 nm)的生色基团主要是肽链。蛋白质的-螺旋在190 nm出现正吸收峰,在208 nm和222 nm出现负吸收峰;-折叠在195 nm出现强正吸收峰,在216 nm出现负吸收峰;-转角在180~190 nm出现强负吸收峰,在205 nm出现正吸收峰,在220~230 nm出现弱负吸收峰;无规则卷曲在198 nm附近出现负吸收峰,在220 nm附近出现小而宽的正吸收峰。
从未加热虾头蛋白的圆二色谱图(图3A、3B、3C)可以看出,在190 nm附近有正吸收峰,在222 nm和208 nm附近有两个弱的负吸收峰,这是-螺旋的特征吸收峰;在196 nm有正吸收峰,在216 nm有负吸收峰,这是-折叠的特征吸收峰。虾头蛋白二级结构主要以-螺旋和-折叠为主。随着加热时间的增加,190 nm的正吸收峰(-螺旋)逐渐消失并转为190 nm 负吸收峰(-转角),196 nm 的正吸收峰(-折叠)也逐渐消失并转为强的负吸收峰(无规则卷曲)。这是因为加热破坏了蛋白质分子内氢键,暴露出分子内的大量基团如巯基和疏水基团等,从而破坏了虾头蛋白原有的二级结构,使不同的二级结构间发生了转换,-螺旋向-转角转变,-折叠向无规则卷曲转变。
图3 加热过程中虾头蛋白圆二色谱和变性程度的变化Fig.3 Changes of the circle dichrosim and denaturation degree of shrimp head protein during heating
蛋白质二级结构椭圆率的变化与变性程度之间存在着一定的对应关系。由图3A、3B和3C可知,定义未加热虾头蛋白为未变性状态,在196 nm的平均摩尔椭圆率为[θ];100 ℃加热5 min的虾头蛋白(椭圆率变化基本不显著)为完全变性状态,在196 nm的平均摩尔椭圆率为 [θ];100 ℃ 加热 0~5 min的虾头蛋白在196 nm的平均摩尔椭圆率为[θ],用公式(5)表征虾头蛋白的变性程度 Δ:
由于虾头蛋白圆二色谱中196 nm处椭圆率的变化比较显著,本实验用196 nm处椭圆率的变化来表征虾头蛋白的变性程度,按照公式(5)计算,结果见图3D。由图3D可知,加热前5 min,随着加热时间的增加,虾头蛋白变性程度显著增加(0.05),当加热到5 min时虾头蛋白变性程度缓慢增加,加热5~8 min虾头蛋白变性程度趋于平稳。圆二色谱的完全变性时间与其他方法不同,这可能是因为破坏蛋白质二级结构需要更多能量,所以完全变性时间发生滞后。
2.4 虾头蛋白内源荧光与变性程度
蛋白质分子中含有三种芳香族氨基酸残基:色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)。在紫外光照射下芳香族氨基酸残基会发射荧光,348 nm为Trp荧光峰,303 nm为Tyr荧光峰,282 nm为Phe荧光峰,其中Trp荧光强度最强。Trp的荧光强度和峰位置与蛋白质构象密切相关,特别是与Trp残基所处的微环境有关。环境极性增加则发射峰红移,疏水性增加则发射峰蓝移,当位于330~332 nm时表示Trp残基处于疏水腔中,当位于342 nm时表明Trp残基部分处于疏水性环境中;当位于350~352 nm时表示Trp残基完全暴露于极性环境中,疏水腔瓦解,蛋白质的结构松弛。
从图4A、4B和4C可以看出,未加热虾头蛋白的内源荧光在340~350 nm,说明虾头蛋白的Trp残基部分处于疏水性环境中;随着加热时间的增加,虾头蛋白的内源荧光逐渐从340~350 nm移动到了350~360 nm,发生了红移,且荧光强度显著增强。这是因为加热过程会破坏虾头蛋白的空间结构,使肽链逐渐伸展,Trp残基逐渐暴露在分子外部的极性环境中。
图4 加热过程中虾头蛋白内源荧光和变性程度的变化Fig.4 Changes of the endogenous fluorescence and denaturation degree of shrimp head protein during heating
由图4A、4B和4C,定义未加热虾头蛋白为未变性状态,荧光最大吸收峰的波长为F;100 ℃加热4 min时(相对红移距离变化不显著)为完全变性状态,荧光最大吸收峰的波长相对F的相对红移距离为F;100 ℃加热0~4 min虾头蛋白的荧光最大吸收峰相对红移距离表征为F,用公式(6)表征虾头蛋白的变性程度Δ:
以波峰相对红移距离为参考,按照公式(6)计算,结果见图4D。从图4D中可以看出,在加热前4 min,随着加热时间的增加,虾头蛋白变性程度显著增大(0.05),在加热4 min时蛋白变性程度达到最大,再增加加热时间,蛋白变性程度也不再显著变化(>0.05)。这同样说明加热4 min使虾头蛋白发生了完全变性。
2.5 不同表征方法的比较分析
对表征虾头蛋白变性程度的不同方法进行比较,结果见图5。从图5可知,对相同浓度的虾头蛋白(图5A、5B和5C),随着加热时间的增加,4种方法表征的蛋白变性程度均呈逐渐增加趋势(<0.05);在加热1~4 min之间时,蛋白变性程度都显著增加(<0.05),随后再延长加热时间,蛋白变性程度均不再显著变化(0.05)。四种蛋白变性表征方法在加热1~4 min之间(即未达到完全变性之前),蛋白变性程度之间存在一些差异,溶解度法所表征的蛋白变性程度显著性大于SDS-PAGE法、圆二色谱法和荧光光谱法(0.05),这是因为四种蛋白变性表征方法采取的检测原理不同。溶解度法检测可溶性蛋白的变化,SDS-PAGE检测分子量的变化,圆二色谱检测二级结构的变化,荧光光谱检测空间结构的变化,且不同方法灵敏度不同,可以看出溶解度法的灵敏度高于其他方法。
图5 不同浓度蛋白变性表征方法的比较Fig.5 Comparison of different concentration characterization methods for protein denaturation
以上结果表明,在同一表征方法中,不同浓度的虾头蛋白在加热过程中变性程度呈S型上升趋势,在加热1~4 min之间时变性速率存在显著差异(<0.05)。在加热1~4 min时(即未达到完全变性之前),60 mg/mL虾头蛋白的变性速率显著慢于30 mg/mL和 40 mg/mL 虾头蛋白的(<0.05),而 30 mg/mL 略高于40 mg/mL虾头蛋白的变性速率。这可能是因为在相同加热条件下,60 mg/mL溶液中蛋白含量较大,热诱导蛋白质分子聚集在一定程度上受到抑制,使蛋白质变性程度降低。因此,蛋白质浓度对蛋白质完全变性时间无影响,但对蛋白变性速率有影响,选择虾头蛋白浓度为30 mg/mL即料液比1:3时虾头蛋白可能会更快达到变性条件。
同时比较四种虾头蛋白变性程度表征方法的可操作性,溶解度法只需测定蛋白质浓度,具有快速、直观、操作简单、测试廉价等优点,而SDS-PAGE法、圆二色谱法和荧光光谱法还需将浓度调至该方法适宜的范围再进行测定,且耗时长、样品使用量大,还需特定的仪器设备。
如上所述,在表征虾头蛋白变性程度时采用溶解度法更加方便快捷,并且考虑原料用量建议选择料液比为1:3可能会更快达到变性条件。
3 结论
研究结果表明:溶解度法、SDS-PAGE法、圆二色谱法、荧光光谱法在定量直观地表征加热过程中虾头蛋白变性程度上具有一致性。在同一表征方法中,不同浓度的虾头蛋白在加热过程中变性程度都呈S型上升趋势,但在加热1~4 min之间变性速率存在差异,其中蛋白溶解度的变性程度对加热时间的灵敏度最为显著。因此溶解度作为测定虾头蛋白变性程度的方法更加方便快捷,并且建议选择料液比为1:3可能会更快达到变性条件。研究结果为食品加工过程中表征蛋白变性程度提供了方法参考。