洋川芎内酯A 联合表柔比星干预膀胱癌5637 细胞的作用机制研究

林 磊，杨树立，孙超群，李宝山

（1.平顶山市第一人民医院泌尿外科，河南 平顶山 467000；2.河南大学第一附属医院泌尿外科，河南 开封 475000）

膀胱癌的发病率和病死率在泌尿系统恶性肿瘤中居首位，其发病率预计在未来十年内将持续上升，严重损害公众健康［1］。 膀胱癌分为非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌，大多数患者为非肌层浸润性膀胱癌，经尿道膀胱肿瘤切除术后复发率为 75%［2］。 膀胱癌由于其高复发率和转移率而不易治愈，化疗或其他全身治疗对其疗效有限，五年生存率低于 50%［3］。 表柔比星（EPI）也称表阿霉素，是经尿道前切除至非肌层浸润性膀胱癌，用以预防癌症复发和进展最常用的膀胱内化疗药物之一［4］。但随着耐药性的出现，使其应用受到很大限制。因此，迫切需要寻找联合用药方案，增加膀胱癌细胞对EPI 的敏感性。 洋川芎内酯类化合物提取自中药川芎、当归等伞形科植物，主要包括洋川芎内酯A（SEA）、洋川芎内酯H、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯D、洋川芎内酯F、洋川芎内酯J、洋川芎内酯M、洋川芎内酯 Q 等［5］。 现代药理学证明，洋川芎内酯化合物具有抗氧化损伤、抗炎、镇痛、抗凝及抗血小板聚集、舒张血管等多种药理作用［6-11］。 近年来的临床应用和实验研究表明，中药及中药活性成分治疗膀胱癌具有明显优势。 已有研究报道，SEA 具有抑制结肠癌细胞增殖的作用［11］。 但目前还没有关于SEA 调节膀胱癌细胞对EPI 敏感性方面的研究，本文旨在研究SEA 影响膀胱癌5637 细胞对EPI 敏感性的作用。

1 材料和方法

1.1 试验药物

SEA（批号M4427）购自美国AbMole 生物技术公司。 化学式 C12H16O2，相对分子质量为 192.25424，纯度＞98%。

1.2 试验动物

12 只SPF 级裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，雄性，6 周龄，体质量（20±3）g，许可证号 SCXK（京）2015-0001。 于 SPF 级别动物饲养房饲养。 保持湿度30%，气温20～25 ℃，每周更换灭菌垫料，按时添加裸鼠饲料及饮水。 动物实验伦理审批号：2020-1011。

1.3 试验试剂

EPI（批号 XY-1752-250）购自美国 biovision 公司；洛斯维·帕克纪念研究所（RPMI）1640 培养基（批号 61870-127）、胎牛血清（批号 26400-036）、青-链霉素（批号 15140-122）、胰蛋白酶（批号 25200-056）购自美国 Gibco 公司；CCK-8 试剂盒（批号 C0037）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（批号P0012）购自上海碧云天生物技术研究所；Annexin V-FITC/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒（批号G003-1-2）购自南京建成生物工程研究所；Anti 多药耐药关联蛋白 1（MRP1，批号 ab233383）、增殖细胞核抗原（PCNA，批号ab92552）、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved caspase-3，批号ab2302）、拓扑异构酶-Ⅱ（Topo-Ⅱ，批号 ab109524）购自英国 Abcam 公司；Anti 肺耐药蛋白（LRP，批号610512）购自美国 BD 公司。

1.4 试验仪器

全自动多功能酶标仪（型号BS-1101）购自北京华泰和合商贸有限公司；流式细胞仪购自美国BD公司；全自动凝胶成像分析系统（型号ZF-288）购自上海金鹏分析仪器有限公司；电热恒温培养箱（型号DHP-360S）购自上海高致精密仪器有限公司。

1.5 细胞培养

人输尿管上皮永生化细胞SV-HUC-1 和人膀胱癌细胞5637 来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，将细胞培养于RPMI 1640 培养基（含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和 1×105U/L 链霉素）中，置于5%二氧化碳、37 ℃的恒温培养箱中培养。 培养基 2 d 更换一次，3～4 d 传代一次，实验用细胞为对数生长期细胞。

1.6 CCK-8 检测细胞活力与增殖

将人输尿管上皮永生化细胞SV-HUC-1 和人膀胱癌细胞 5637 接种于 96 孔板（100 μL/孔）孵育 24 h 后，用不同剂量（0、0.5、1、5、10、20、40、80、160 μmol/L）SEA 处理细胞，每孔加入 10 μL CCK-8 溶液孵育 4 h，在450 nm 处用酶标仪测定光密度（OD）值，并计算半数抑制浓度（IC50）值。 选用人膀胱癌细胞5637 进行后续实验。

1.7 细胞分组

采用SEA 处理人膀胱癌细胞5637 细胞，将细胞分为对照组、SEA 低剂量组（SEA10 组）、SEA 中剂量组（SEA20 组）、SEA 高剂量组（SEA40 组）、EPI 单独处理组（EPI 组）和联合处理组（SEA40+EPI 组）。SEA 低、中、高剂量组分别用 10、20、40 μmol/L 剂量 SEA 处理细胞，EPI 质量浓度为 1.2 μg/mL［4］，联合处理组SEA 剂量为40 μmol/L。

1.8 流式细胞仪检测细胞凋亡

取对数生长期细胞离心5 min，弃上清，收集细胞，用PBS 重悬细胞并计数；取1×105重悬细胞，3500 r/min 离心5 min，离心半径 8 cm，弃上清，加入500 μL 结合液轻轻重悬细胞，加入 5 μL Annexin VFITC，轻轻混匀；再加入5 μL 碘化丙啶，轻轻混匀。室温避光孵育10 min。 用流式细胞仪进行检测，Annexin V-FITC 为绿色荧光，PI 为红色荧光。 Q1 为坏死细胞，Q2 为晚期凋亡细胞，Q3 为正常细胞，Q4为早期凋亡细胞，细胞凋亡率=Q2+Q4。

1.9 裸鼠移植瘤模型建立［12］

各组裸鼠后肢腹侧皮下分别注射0.2 mL 的1×107个/mL 膀胱癌细胞5637 悬液，接种24 h 后将裸鼠随机分为对照组、SEA 药物组、EPI 药物组和SEA+EPI组。 SEA 组裸鼠灌胃 SEA 20 mg/kg［13-15］，EPI 组裸鼠皮下接种部位注射 EPI 0.002 mg/kg［16］，SEA+EPI组灌胃SEA 20 mg/kg 并同时于皮下接种部位注射EPI 0.002 mg/kg，对照组灌胃等量生理盐水并于皮下接种部位注射等量生理盐水，连续30 d。

1.10 肿瘤体积

模型建立后每隔5 天用游标卡尺记录所成瘤的长径和短径，肿瘤体积 = 长径×短径2×1/2［17］。 在第30 天记录移植瘤的长径和短径后，断颈法处死裸鼠。

1.11 免疫蛋白质印迹（Western Blot）法检测MRP1、LRP、Topo-Ⅱ、PCNA、cleaved caspase-3 蛋白表达

先将各组待测细胞与裸鼠移植瘤肿瘤组织用PBS 清洗3 次，再加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行总蛋白提取，BCA 试剂盒测定蛋白质含量，提取等量的蛋白质样品，100 ℃变性5 min。 然后进行SDS-PAGE 凝胶电泳分离并转移至PVDF 膜，5%的BSA 室温封闭1～2 h 后加入相应的一抗，4 ℃过夜孵育，次日，清洗后再加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，清洗。 最后加入发光液后，于凝胶成像仪进行曝光拍照，并用ImageJ 软件统计灰度值，计算相对表达量。 GAPDH 作为上样量参照，至少重复三个独立的实验。

1.12 统计学方法

使用SPSS 17.0 软件对实验数据进行统计学分析。 数据表示为，各组间比较采用方差分析法。取α=0.05 为检验水准。

2 结果

2.1 SEA 对SV-HUC-1 细胞和人膀胱癌5637 细胞活力的影响

采用CCK-8 试剂盒检测SV-HUC-1 细胞和5637癌细胞活力，见图 1。 与 0 μmol/L 剂量时相比，5637癌细胞 10、20、40 μmol/L 剂量时细胞存活率显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），SV-HUC-1 细胞80 μmol/L 剂量时细胞存活率显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；5637 癌细胞 40 μmol/L 剂量时细胞存活率显著低于SV-HUC-1 细胞40 μmol/L剂量，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 通过计算得出 SV-HUC-1 细胞 IC50值为 148.754 μmol/L，5637 膀胱癌细胞 IC50值为 94.273 μmol/L，说明 SEA 对 SVHUC-1 细胞和5637 癌细胞具有杀伤力，且对5637膀胱癌细胞杀伤力高于SV-HUC-1 细胞。

图1 洋川芎内酯A 对SV-HUC-1 细胞和人膀胱癌5637 细胞活力的影响

2.2 SEA 对人膀胱癌5637 细胞凋亡和增殖的影响

采用流式细胞仪检测人膀胱癌5637 细胞凋亡结果。 对照组细胞凋亡率显著低于SEA20 组和SEA40组，EPI 组细胞凋亡率显著高于对照组，SEA40+EPI组细胞凋亡率显著高于EPI 组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。 对照组 450 nm 处 OD 值显著高于SEA20 组、SEA40 组和 EPI 组，SEA40+EPI 组 450 nm处OD 值显著低于EPI 组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。 见图 2、表 1。

表1 洋川芎内酯A 对人膀胱癌5637 细胞凋亡与增殖的影响（）

表1 洋川芎内酯A 对人膀胱癌5637 细胞凋亡与增殖的影响（）

注：SEA 为洋川芎内酯 A，EPI为表柔比星，OD 为光密度。 与对照组比较，*P＜0.05；与 EPI 组比较，#P＜0.05。

组别 细胞凋亡率/% OD 值（450 nm）对照组 3.01±0.41 5.3±0.50 SEA10 组 4.32±0.52 5.1±0.38 SEA20 组 7.31±0.27* 4.9±0.42*SEA40 组 12.38±2.23* 4.3±0.40*EPI 组 45.27±5.59* 3.2±0.45*SEA40+EPI 组 60.23±7.06# 1.8±0.34#

图2 洋川芎内酯A 对人膀胱癌5637 细胞凋亡的影响

2.3 SEA 对人膀胱癌 5637 细胞 MRP1、LRP、Topo-Ⅱ蛋白水平的影响

采用Western Blot 检测人膀胱癌细胞5637 中MRP1、LRP、Topo-Ⅱ蛋白水平，结果如表 2、图 3 所示。 对照组MRP1 蛋白水平显著高于SEA20 组和SEA40 组，EPI 组MRP1 蛋白水平显著高于对照组，SEA40+EPI 组MRP1 蛋白水平显著低于 EPI 组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；对照组LRP 蛋白水平显著高于 SEA20 组和 SEA40 组，EPI 组 LRP 蛋白水平显著高于对照组，SEA40+EPI 组LRP 蛋白水平显著高于 EPI 组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；对照组Topo-Ⅱ蛋白水平显著低于SEA20 组和SEA40组，EPI 组 Topo-Ⅱ蛋白水平显著低于对照组，SEA40+EPI 组Topo-Ⅱ蛋白水平显著高于EPI 组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

图3 洋川芎内酯A 对人膀胱癌5637 细胞MRP1、LRP、Topo-Ⅱ蛋白水平的影响

表2 洋川芎内酯 A 对人膀胱癌 5637 细胞 MRP1、LRP、Topo-Ⅱ蛋白水平的影响（，kDa）

表2 洋川芎内酯 A 对人膀胱癌 5637 细胞 MRP1、LRP、Topo-Ⅱ蛋白水平的影响（，kDa）

注：SEA 为洋川芎内酯A，EPI为表柔比星，MRP1 为多药耐药相关蛋白1，LRP 为肺耐药蛋白，Topo-Ⅱ为拓扑异构酶-Ⅱ。 与对照组比较，*P＜0.05；与 EPI 组比较，#P＜0.05。

组别 MRP1 LRP Topo-Ⅱ对照组 0.35±0.04 0.40±0.05 0.39±0.04 SEA10 组 0.27±0.02 0.36±0.02 0.51±0.06 SEA20 组 0.18±0.01* 0.25±0.03* 0.63±0.07*SEA40 组 0.10±0.02* 0.18±0.02* 0.86±0.09*EPI 组 1.06±0.12* 1.15±0.15* 0.16±0.02*SEA40+EPI 组 0.43±0.04# 1.42±0.05# 0.45±0.05#

2.4 SEA 对裸鼠移植瘤模型肿瘤生长的影响

构建裸鼠移植瘤模型，检测30 d 内肿瘤体积的变化，如图4 所示。 对照组肿瘤体积显著大于SEA药物组和EPI 药物组，SEA+EPI 组肿瘤体积显著小于EPI 药物组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

图4 洋川芎内酯A 对肿瘤生长的影响

2.5 SEA 对裸鼠移植瘤模型 MRP1、PCNA、cleaved caspase-3 蛋白水平的影响

Western Blot 检测裸鼠移植瘤中MRP1、PCNA、cleaved caspase-3 蛋白水平结果如表 3、图5 所示。对照组MRP1 蛋白水平显著高于SEA 药物组，EPI药物组MRP1 蛋白水平显著高于对照组，SEA+EPI组MRP1 蛋白水平显著低于EPI 组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；对照组PCNA 蛋白水平显著高于SEA药物组和 EPI 药物组，SEA+EPI 组 PCNA 蛋白水平显著低于EPI 组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；对照组cleaved caspase-3 蛋白水平显著低于SEA药物组和EPI 药物组，EPI 药物组cleaved caspase-3蛋白水平显著低于SEA+EPI 组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

图5 洋川芎内酯A 对裸鼠移植瘤MRP1、PCNA、cleaved caspase-3 蛋白水平的影响

表3 洋川芎内酯A 对裸鼠移植瘤MRP1、PCNA、cleaved caspase-3 蛋白水平的影响（，kDa）

表3 洋川芎内酯A 对裸鼠移植瘤MRP1、PCNA、cleaved caspase-3 蛋白水平的影响（，kDa）

注：SEA 为洋川芎内酯A，EPI为表柔比星，MRP1 为多药耐药相关蛋白1，PCNA 为增殖细胞核抗原，cleaved caspase-3 为裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3。 与对照组比较，*P＜0.05；与EPI 药物组比较，#P＜0.05。

组别 MRP1 PCNA cleaved caspase-3对照组 0.58±0.06 1.30±0.10 0.27±0.04 SEA 药物组 0.10±0.02* 0.95±0.09* 0.48±0.05*EPI 药物组 0.98±0.12* 0.32±0.03* 0.79±0.08*SEA+EPI 组 0.40±0.04# 0.06±0.01# 0.96±0.09#

3 讨论

膀胱癌是常见的尿路上皮恶性肿瘤，虽然可通过手术、化疗或放疗消除原发膀胱癌肿瘤，但肿瘤经常复发并可能发展为肌肉浸润性疾病［18-19］。 复发性肿瘤获得耐药性是限制癌症治疗的关键因素，常见化学制剂的耐药性涉及多种机制，这些机制可以是内在的，也可以是在治疗过程中获得［20］。

川芎多用于治疗脑血管和心血管疾病，包括中风、高血压、心率失常和内分泌失调等［21］。 SEA 是川芎的主要成分之一，用于治疗心脑血管疾病和偏头痛［22］。 Wang 等［23］研究发现 SEA 对结肠癌细胞 HT-29具有细胞毒性，并以剂量依赖的方式抑制其增殖。PCNA 又称周期数，是评价细胞增殖的指标，PCNA在膀胱癌的发生发展中起重要作用，检测其蛋白表达水平，可辅助常规病理诊断，改善膀胱癌患者的预后［24］。 本研究发现，SEA 具有下调 PCNA 蛋白表达、降低人输尿管上皮永生化细胞SV-HUC-1 和人膀胱癌细胞5637 细胞活力、抑制人膀胱癌细胞5637 细胞增殖的作用，与EPI 联合应用对膀胱癌细胞的杀伤性优于单独使用EPI。

细胞凋亡是响应异常和细胞损伤的重要细胞机制，异常凋亡反应在癌症发生发展过程中十分常见［25］。 细胞凋亡是细胞程序性死亡，治疗癌症的化学预防策略之一就是诱导细胞凋亡［26］。 杨帆等［27］研究发现茶多酚联合EPI 可通过上调cleaved caspase-3蛋白表达，增强EPI 对膀胱癌T24 细胞的致凋亡敏感性。 本研究结果与上述研究结果一致，SEA 上调人膀胱癌细胞5637 cleaved caspase-3 蛋白表达，促进人膀胱癌细胞5637 凋亡。 且SEA 与EPI 联合促细胞凋亡效果优于单独使用EPI，说明SEA 能增强EPI 对膀胱癌的敏感性。

对化学治疗药物的耐药性通过几种药物代谢发生。 MRP1 作为重要的ATP 结合盒转运蛋白，通过改变药物流入或外排影响细胞内药物浓度，且多重耐药是膀胱癌治疗的严重障碍［28］。 MRP1 的过表达可减少细胞内浓度、降低抗癌药物的细胞毒性，因此，抑制多药耐药蛋白表达是提高化疗敏感性的潜在途径。 Topo-Ⅱ是许多抗癌药的主要靶标。 当靶酶Topo-Ⅱ的活性和敏感性通过下调或突变降低时，发生对Topo-Ⅱ的耐药性［29］。 LRP 通过胞吐囊泡或泵分子从细胞内药物靶标中泵出药物来介导耐药性［30］。Wang等［31］研究发现川芎嗪通过下调 MRP1、LRP，上调 Topo-Ⅱ逆转人膀胱癌多药耐药。 Wang 等［32］研究发现白藜芦醇通过降低MRP1、LRP 表达水平，增加Topo-Ⅱ表达水平，从而改善膀胱癌耐药性。 本研究结果与上述研究结果一致，SEA 在体内与体外实验均可下调MRP1 水平，体外实验下调人膀胱癌细胞5637 LRP 蛋白水平，上调人膀胱癌细胞5637 Topo-Ⅱ蛋白水平，且与EPI 联合应用效果优于单独使用EPI。 说明SEA 具有降低EPI 耐药性的作用。

本文揭示了SEA 增加人膀胱癌5637 细胞对EPI 敏感性的作用：SEA 降低人输尿管上皮永生化细胞SV-HUC-1 和人膀胱癌细胞5637 细胞活力，促进人膀胱癌细胞5637 细胞凋亡，降低人膀胱癌细胞5637 MRP1、LRP 蛋白水平，升高人膀胱癌细胞5637 Topo-Ⅱ蛋白水平，抑制体内移植瘤生长，降低体内移植瘤MRP1、PCNA 蛋白水平，升高体内移植瘤cleaved caspase-3 蛋白水平，且与EPI 联合应用效果优于单独应用EPI。 本研究为治疗膀胱癌提供了新的方法和思路，也为EPI 与SEA 的联合应用提供了实验基础，但具体临床效果还待进一步研究。