阿魏酸对去卵巢大鼠骨微结构的影响

董晓敏 王朝南 林瑞芳 林雅静

骨质疏松症是因骨代谢平衡失调导致的以骨强度降低、骨折风险增加为特征的骨骼系统疾病，表现为骨量减少、骨微结构破坏，进而引起骨脆性增加，容易发生骨折[1]。骨质疏松症相关性疾病的发病率、致残率和病死率在老年患者中逐年增加，尤其是绝经后妇女罹患骨质疏松症远大于男性，主要与雌激素缺乏相关，通过积极治疗延缓骨量减少速度，可显著减低骨折发生，对已发生骨折的患者也可有效防止再次发生骨折。阿魏酸是一种酚酸类成分，是抗骨质疏松症常用中药当归、川芎的有效成分之一。除抗氧化作用外，研究表明，阿魏酸还能通过调节凋亡基因，从而发挥抗成骨细胞凋亡的作用[2]。阿魏酸可刺激体外培养的成骨细胞增殖、分化和矿化，促进成骨相关基因的表达[3]。本研究通过观察阿魏酸对去势骨质疏松症大鼠骨微结构和骨代谢的影响，探讨其防治骨质疏松症的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取2 月龄Wistar 雌性大鼠40只，体质量为（225±25）g，实验动物由温州医科大学动物实验中心提供。实验中，所有大鼠自由进食和饮水，使用标准饲料，其中钙含量为1%，磷含量0.8%，70%～80%碳水化合物和5%脂肪。饲养环境温度25 ℃，相对湿度50%～70%，12 h 昼夜循环周期。本研究得到温州医科大学动物实验中心伦理委员会批准（批号wydw2021-0580）。

1.2 试剂和仪器 阿魏酸（上海源叶生物科技有限公司，批号B20007）、碱性磷酸酶（ALP）（上海酶联生物科技有限公司，批号ml003360）、骨钙素酶联免疫吸附测定（ELISA）检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，批号ml002883）。双能X 线骨密度仪（美国Hologic 公司，型号：Discovery Wi）、Micro-CT（德国BRUKER 公司，型号：Skycan1276）、LEICA RM2235切片机（德国LEICA 公司，型号：RM2235）、生物显微镜（德国Zeiss 公司，型号：Axio Lab.A1）。

1.3 分组和模型制备 所有大鼠适应性喂养1 周后，40 只Wistar 雌性大鼠采用随机数字表法分为假手术组、模型组、阿魏酸低剂量组和阿魏酸高剂量组，每组10 只。使用1%戊巴比妥（30 mg/kg）腹腔注射麻醉所有大鼠，在左右软肋下剪开皮肤，分离筋膜，显露腹腔，找到双侧卵巢及周围组织，其中假手术组仅切除卵巢周围脂肪组织（卵巢大小），模型组、阿魏酸低剂量组和阿魏酸高剂量组切除双侧卵巢组织建立骨质疏松模型。手术结束时所有大鼠均给予青霉素预防感染，过程顺利，无大鼠死亡。术后所有大鼠连续3 d 肌注青霉素钠预防感染（每天20 万U）。术后1 周，待大鼠状态恢复后，开始喂养干预。假手术组和模型组给予生理盐水[50 mL/（kg·d）]灌胃，阿魏酸低剂量组和阿魏酸高剂量组分别给予等量阿魏酸[20、80 mg/（kg·d）]灌胃，药物剂量参考文献[4]，研究显示该剂量可改善骨质高转换状态。每天上午灌胃1 次，连续12 周。

1.4 检测指标 治疗结束时用适量水合氯醛麻醉处死大鼠，经下腔静脉采血，4 ℃离心分离制备血清，使用全自动生化仪测定血钙、血磷浓度，按照ALP 及骨钙素ELISA 试剂盒说明测定ALP 和骨钙素（OC）水平。获取各组大鼠双侧股骨，剔除肌肉等结缔组织，对右侧股骨采用骨密度仪及Micro-CT 测定骨密度和骨微结构参数，包括皮质骨骨小梁体积比率（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁数目（Tb.N）、骨小梁间隙（Tb.Sp）。各组大鼠左侧股骨取10%甲醛固定液固定24 h，转75%乙醇脱水过夜，常规石蜡包埋，制作病理学切片，片厚3 μm，HE 染色，生物显微镜下观察股骨HE 染色情况及骨小梁形态。

1.5 统计学方法 应用SPSS 19.0 统计软件分析数据。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，多组间样本比较采用单因素方差分析（oneway ANOVA）分析，两两比较采用LSD-t 检验，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 阿魏酸对大鼠血清骨代谢指标的影响 给药12 周后，与模型组比较，阿魏酸低、高剂量组大鼠血清钙、磷浓度和ALP 含量均无明显差异（P＞0.05），阿魏酸低、高剂量组大鼠OC 含量有所下降，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 各组大鼠骨代谢指标比较（）

表1 各组大鼠骨代谢指标比较（）

注：假手术组为仅切除卵巢周围脂肪，未切除卵巢；模型组为手术切除双侧卵巢，等量生理盐水灌胃；阿魏酸低剂量组为手术切除双侧卵巢，给予阿魏酸20 mg/（kg·d）灌胃；阿魏酸高剂量组为手术切除双侧卵巢，给予阿魏酸80 mg/（kg·d）灌胃；ALP 为碱性磷酸酶；OC 为骨钙素；与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05

2.2 阿魏酸对大鼠股骨骨小梁的影响 在股骨骨微结构测定上，与假手术组比较，模型组大鼠骨密度、BV/TV、Tb.Th 以及Tb.N 都有不程度下降，而Tb.Sp增大（P<0.05）；与模型组比较，阿魏酸低、高剂量组骨密度、BV/TV、Tb.Th 以及Tb.N 均有明显回升，而Tb.Sp 变小（P<0.05），见表2。

表2 各组大鼠股骨近端骨骨微结构指标比较（）

表2 各组大鼠股骨近端骨骨微结构指标比较（）

注：假手术组为仅切除卵巢周围脂肪，未切除卵巢；模型组为手术切除双侧卵巢，等量生理盐水灌胃；低剂量组为手术切除双侧卵巢，给予阿魏酸20 mg/（kg·d）灌胃；高剂量组为手术切除双侧卵巢，给予阿魏酸80 mg/（kg·d）灌胃；BMD 为骨密度；BV/TV 为骨小梁体积比率；Tb.Th 为骨小梁厚度；Tb.N 为骨小梁数目；Tb.Sp 为骨小梁间隙；与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05

2.3 股骨组织切片观察 股骨干骺端HE 染色如下图显示，与假手术组比较，模型组切除双侧卵巢后，大鼠股骨骨松质骨小梁排列变薄稀疏，髓腔增大；与模型组比较，阿魏酸组组织切片显示骨皮质增厚且连续，骨小梁相对体积变大，数量增多，表明骨结构有所恢复。见图1。

3 讨论

绝经后女性由于雌激素的缺乏，造成骨吸收和骨成形的动态平衡失调，导致骨成形率低于骨吸收率，进而使得体内骨量减少和骨强度逐渐下降[5]。中药治疗骨质疏松，在有效改善骨量的同时，能明显减少相关不良反应的发生[6]。研究表明，去势大鼠模型的雌激素、骨骼变化和绝经后妇女改变相似[7]，故本研究通过去势大鼠建立绝经后骨质疏松模型来研究阿魏酸抗骨质疏松的作用。

研究发现，氧化应激会抑制成骨细胞分化，增加破骨细胞的分化的吸收功能[8]，被认为是骨质疏松症的发病机制中重要原因[9]。众所周知，阿魏酸被认为具有抗炎抗氧化等多种生物作用[10]。在诱导缺氧诱导因子通路传导时，阿魏酸同时会促进β-连环蛋白在间充质干细胞表达，此过程可促进间充质干细胞成骨，增加ALP 和OC 的含量[11]，同时促进成骨细胞表达骨保护素mRNA 和骨活素mRNA，诱导生成钙化结节，进而促进成骨形成。有学者发现，阿魏酸40～640 μmol/L 浓度时可以促进骨细胞钙化结节形成，在40～2560 μmol/L 浓度时会促进成骨细胞分化功能[3]。ALP 是成骨细胞分化早期特异性标志之一，而骨钙素不仅是成骨细胞活性标志[12]，还能反映骨转化状态，即血清骨钙素水平会随着骨转化增强而升高[13]。在实验中，经过去卵巢处理，缺乏雌激素的模型组和阿魏酸组大鼠血清ALP 和OC 浓度都高于假手术组，同时由于阿魏酸低、高剂量组均能抑制骨转化过程中血清OC 水平的升高，实验中测定OC 含量均低于模型组（P＜0.05），这也反映阿魏酸具有增强成骨细胞活性、促进增殖分化的作用。此外，有学者发现雌激素受体亚型GPR30 对骨保护有重要作用[14]，阿魏酸等中药的相关活性成分可通过特异性激活GPR3O 通路促进骨生长，还能避免传统雌激素替代治疗引起子宫内膜增厚等副作用[2]。目前已知破骨细胞是体内唯一具有骨吸收能力的细胞，在骨代谢中破骨细胞的数量和活性与骨质疏松症的形成密切相关[15]。

研究表明，核因子κB（NF-κB）信号通路是介导骨吸收和骨成形之间平衡的重要通路[16]，其中NFκB 是成熟破骨细胞存活和发挥作用的关键调节因子[17]。阿魏酸通过下调核因子κB 受体活化因子配体（RANKL）诱导的NF-κB 活化水平，抑制RANKL 诱导的破骨细胞分化，从而减少破骨细胞的生成，并使破骨细胞的骨吸收活性下降[18]。研究表明，通过Micro-CT 观察骨微结构能较灵敏反映骨质疏松症的早期表现[19]。本实验结果显示，通过去势干预，模型组大鼠股骨骨小梁排列稀疏变薄，髓腔变大，而阿魏酸组的大鼠骨皮质增厚且连续，皮质骨量增加，松质骨网结构致密，且骨量增加与阿魏酸剂量成正相关，大鼠BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th 较模型组显著增加，Tb.Sp呈下降趋势（P＜0.05），表明阿魏酸在合适浓度范围内可以防止骨质流失，增加骨矿沉积，纠正雌激素缺乏的骨代谢失衡，改善去势骨质疏松症的骨微结构，这对预防骨质疏松有重要作用。

总之，本研究结果表明，阿魏酸对去势大鼠骨微结构有一定改善作用，可促进骨形成，增加骨量，可能是治疗骨质疏松的潜在选择。