卡格列净通过Sirt1/Claudin-1/β-catenin/Snail 信号通路对糖尿病肾病模型小鼠肾脏的保护作用

刘恺远 牟 新 周迪夷 陈丽君

糖尿病肾脏疾病（diabetes kidney disease，DKD）是最严重的糖尿病微血管并发症之一，最终进展为终末期肾病[1]。卡格列净是较早应用于临床的钠－葡萄糖同向转运蛋白2（sodium-glucose cotransporter 2，SGLT-2）抑制剂之一。研究发现，卡格列净具有不依赖于降血糖的肾脏保护作用，明显减少DKD 患者的尿蛋白及肌酐水平，能够延缓DKD 的进展[2]。本研究旨在探究卡格列净对DKD 模型小鼠肾脏的保护作用及其分子机制。

1 实验材料

1.1 动 物 SPF 级T2DM 模型6 周龄db/db 雄性小鼠12 只，C57BL/KsJ-+/db 雄性小鼠6 只，购买自杭州杭斯生物有限公司，生产许可证号：SYXK（浙）2018-0012。饲养繁殖环境：饲养于浙江中医药大学动物实验中心，单笼鼠料喂养。饲养室温度控制在（23±2）℃并保持60%湿度。本研究获浙江动物伦理委员会审核（批件编号：20200803-03）。

1.2 试验药品 高脂饲料（江苏省协同医药生物工程有限责任公司，批号1019004）；卡格列净（Merck公司，100 mg，批号KCL5000）。

1.3 试剂与仪器 RIPA 裂解液（上海碧云天生物有限公司，批号P0013B）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物有限公司，批号082820201207）；PMSF（上海碧云天生物有限公司，批号ST506）；PVDF 膜（Millipore 公司，批号ISEQ00010）；SDSPAGE 凝胶配制试剂盒（上海碧云天生物有限公司，批号111420201123）；脱脂奶粉（上海源叶生物科技有限公司，批号S30865）；Tween20（上海源叶生物科技有限公司，批号S15016）；超敏ECL 化学发光试剂盒（上海碧云天生物有限公司，批号0820201116）；小鼠胰岛素ELISA 试剂盒（钰博生物有限公司，批号ED202012224）；小鼠C 肽ELISA 试剂盒（钰博生物有限公司，批号ED202012224）；一抗：SIRT1（美国abcam 公司，批号ab 189474；）Claudin1（美国abcam公司，批号ab180158）；β-catenin（美国abcam 公司，批号ab32572）；Snail（美国cst 公司，批号3879S；）βactin（杭州宝科生物科技有限公司，批号BK7018）；二抗：Anti-rabbit IgG，HRP-linked Antibody（美国cst 公司，批号7074S）；血糖仪（罗氏ACCU-CHEK performa，型号79530618328）；恒温水浴箱（赛默飞，型号TSCIR35）；低温高速离心机（Sigma 贝克曼（Beckman），型号B30142）；电泳仪（Bio-RAD，型号E1100）；显影仪（勤翔，型号610020-9Q）；全自动生化分析仪（雅培公司；型号C16000）。

2 实验方法

2.1 造模及分组 适应性喂养1 周后，6 只C57BL/KsJ-+/db 雄性小鼠给予普通饲料，作为正常对照组（NC 组）；12 只SPF 级T2DM 模型db/db 雄性小鼠给予高脂饲料2 周造模并复制DKD 模型[3]，造模成功后，DKD 模型小鼠按照随机数字表法分为DKD 组和卡格列净（Canagliflozin）干预组（DKD+Can 组），每组6 只。

2.2 给 药 NC 组、DKD 组分别予生理盐水10 mL/kg，灌胃，1 次/d；卡格列净给药剂量依据文献检索得出，干预组予卡格列净10 mg/（kg·d），灌胃，1次/d，灌胃12 周[4]。

2.3 观察指标

2.3.1 生化代谢检测 每周测定小鼠体质量尾静脉测小鼠空腹血糖和随机血糖；全自动化分析仪测血清胰岛素、C 肽、血肌酐、尿素氮。代谢笼收集各组小鼠24 h 尿液标本取上清液检测尿蛋白。

2.3.2 肾组织病理 实验结束时，取出肾脏组织，称重后，部分于Bouin 液中固定，行PAS 染色，光镜下观察各组观察肾单位形态结构。

2.3.3 Western blot 技术检测肾脏组织沉默信息调节因子1（Sirt1）、紧密连接蛋白-1（Claudin-1）、β 连接素（β-catenin）、锌指转录因子（Snail）水平 裂解液提取细胞蛋白，摇匀后取上清液，BCA 法测蛋白浓度，上样电泳，转移PVDF 膜上，用5%脱脂奶粉摇床室温封闭2 h，依次加入相应特异性一抗、二抗。放入ECL 发光试剂应用图像分析系统显影并分析灰度值并分析，结果用目的蛋白与β-actin 相对表达量来表示。

2.4 统计学方法 应用SPSS 19.0 软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（）表示，组间多重比较采用单因素方差分析（ANOVA），P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组小鼠一般指标比较 干预治疗12 周后，三组小鼠在进食量、血清C 肽、胰岛素水平均无明显差异（P＞0.05）。与NC 组小鼠比较，DKD 组及DKD+Can组小鼠12 周空腹血糖及HbA1c 明显升高（P＜0.05），与NC 组比较，DKD 组及DKD+Can 组体质量明显增加（P＜0.01），符合2 型糖尿病小鼠高血糖模型。见表1。

3.2 各组小鼠血清肌酐、尿素氮、尿蛋白/肌酐比值比较 三组小鼠在血肌酐、尿素氮无明显差异（P＞0.05）。相对于NC 组，DKD 组尿蛋白/肌酐比值明显升高（P＜0.01），经过卡格列净干预后，与DKD 组小鼠比较，DKD+Can 组小鼠体质量及尿蛋白/肌酐比值明显下降（P＜0.05），见表1。

表1 各组小鼠生化指标比较（）

表1 各组小鼠生化指标比较（）

注：NC 组为正常对照组；DKD 组为糖尿病肾病组；DKD+Can 组为卡格列净干预糖尿病肾病组；HbA1c 为糖化血红蛋白；与NC 组比较，aP＜0.05；与DKD 组比较，bP＜0.05

3.3 Western blot 技术检测小鼠肾脏Sirt1、Claudin-1、β-catenin、Snail 蛋白表达水平 Western blot 结果显示，与NC 组比较，DKD 组Sirt1 蛋白表达水平下降（P＜0.01）；与DKD 组比较，DKD+Can 组Sirt1 蛋白表达水平上升（P ＜0.01）；DKD 组Claudin-1、βcatenin、Snail 表达较NC 组升高（P 均＜0.01）。DKD+Can 组Claudin-1、β-catenin 和Snail 表达水平较DKD 组下降（P 均＜0.01），见表2、图1。

表2 各组小鼠肾组织Sirt1、Claudin-1、β-catenin、Snail 蛋白相对表达量比较（）

表2 各组小鼠肾组织Sirt1、Claudin-1、β-catenin、Snail 蛋白相对表达量比较（）

注：NC 组为正常对照组；DKD 组为糖尿病肾病组；DKD+Can 组为卡格列净干预糖尿病肾病组；Sirt1 为沉默信息调节因子1；Claudin-1 为紧密连接蛋白-1；β-catenin 为连接素；Snail 为锌指转录因子；β-actin 为内参；与NC 组比较，aP＜0.05；与DKD 组比较，bP＜0.01

3.4 肾脏病理 各组小鼠肾小球PAS 染色结果显示，NC 组、DKD 组小鼠出现肾小球硬化，在使用卡格列净12 周后DKD 小鼠肾小球损伤减轻。见图2。

4 讨论

卡格列净作为SGLT2 抑制剂的一种，不同于以往降糖药物，降血糖机制是降低肾糖阈，增加尿糖、尿钠排泄及轻度渗透性利尿，因此带走一部分热量及水分，减低球内压，能够使血糖及血压降低，体质量减轻[5]。除上述作用之外，CREDENC 研究表明，卡格列净降低尿蛋白、血肌酐水平，延缓DKD 进展作用，可能与降低肾小球内滤过压，改善肾脏氧合水平相关，但具体作用机制尚未完全明确[6]。

本研究发现，在高脂饮食诱导下，DKD 小鼠出现肾小球硬化，在使用卡格列净12 周后DKD 小鼠尿蛋白明显减少，肾小球损伤减轻，由此提示卡格列净对DKD 小鼠肾脏的保护作用。Westren blot 显示，DKD 小鼠中Sirt1 水平下降，Claudin-1、β-catenin/Snail 水平升高，而使用卡格列净后，Sirt1 水平明显上调，Claudin-1、β-catenin/Snail 下调，这表示卡格列净能可能通过经过上调Sirt1，下调Claudin-1 水平对DKD 小鼠肾脏起保护作用。

Sirt1 与体内多种生理功能的调节密切相关，包括基因转录、能量代谢、肿瘤发生以及细胞衰老等，在糖代谢、脂代谢和胰岛素分泌调节中发挥着更加重要的作用。研究表明，Sirt1 与DKD 发病过程密切相关，Sirt1 水平下降通过多个信号通路调节下游蛋白活性，参与DKD 生理病理过程[7]。Sirt1 激活剂在DKD 病程中起保护作用，有抗氧化、抗纤维化及抑制炎症等作用，因此Sirt1 激活剂成为治疗DKD 的候选药物[8]。Hasegawa 等[9]研究发现，在DKD 小鼠模型中Sirt1 水平下降及Claudin-1 水平上调，与β-catenin和Snail 的表达增加有关，并且在培养的足细胞中减少突触素、下调突触足蛋白的表达，最终导致足细胞消失，引起蛋白尿。而在本研究中，卡格列净能够通过上调Sirt1 水平，下调Claudin-1、β-catenin、Snail 蛋白表达逆转了这一过程。

综上所述，本研究结果显示，卡格列净能减少DKD 小鼠模型尿蛋白，改善肾脏损伤，从而延缓DKD 进展，机制之一可能与激活Sirt1/Claudin-1/βcatenin/Snail 信号通路有关。