miR-103 通过NF-κB 通路上调MGMT 表达诱导胃癌细胞紫杉醇耐药

高晓丹 王丽洁 王书梦 苏 洁

胃癌（gastric carcinoma）是常见的消化系统肿瘤。紫杉醇（paclitaxel，PTX）作为天然抗癌药物，在胃癌化疗中疗效确切[1]。但获得性耐药的出现往往导致PTX 治疗失败。微小RNA-103（miRNA-103，miR-103）是一种可参与肝癌、肺癌、胶质瘤等恶性生物学行为的miRNA[2-4]。研究显示，miR-103 参与恶性肿瘤化疗耐药[5]。但miR-103 与胃癌PTX 耐药的关系还不明确。核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路已被发现在多种恶性肿瘤化疗耐药中发挥作用[6-7]。最新研究显示，miR-103 能够靶向TLR4 而抑制NFκB 磷酸化水平[8]，提示miR-103 在NF-κB 信号通路中可能发挥抑制作用。O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）是NF-κB 参与恶性肿瘤细胞耐药的重要下游信号分子[9]。但目前miR-103 是否通过NF-κB/MGMT 介导胃癌PTX 耐药还不清楚。本研究通过构建PTX 耐药胃癌细胞，观察miR-103 对胃癌PTX 耐药的影响，并探讨NF-κB/MGMT 在其中的作用，现报道如下。

1 实验材料

1.1 细 胞 人胃癌NCI-N87 细胞购自中国科学院典藏培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.2 主要试剂 PTX（批号20211212）购自南京本草益康生物科技有限公司；miR-103 抑制物（miR-103 inhibitor）转染试剂盒购自上海吉玛公司；四甲基偶氮唑盐比色[3-（4，5-Dimethylthia-zol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]和结晶紫染液购自上海碧云天公司；逆转录聚合酶链式反应试剂盒（含引物）（批号0000173942）和实时荧光定量PCR（RTqPCR）试剂盒（批号0000170712）购自美国Promega公司；miR-103 和U6 合成引物购自上海生工生物；RIPA 总蛋白提取试剂盒购自北京索莱宝公司；胎牛血清（FBS，批号2132094P）、DMEM 高糖培养基（批号8120033）、磷酸盐缓冲液（PBS，批号AE29449009）购自美国Gibco 公司；NF-κB p65（1∶1000）（批号06）、p-NF-κB p65（1∶1000）（批号12）、IκBα（1∶1000）（批号23）抗体及荧光二抗（1∶500）（批号02）抗体购自美国CST 公司；MGMT（1∶1000）（批号GR3301548-3）抗体购自美国Abcam 公司；GAPDH（1∶1000）（批号15）抗体购自南京Bio-World 公司；抗鼠和抗兔IgG、HRP-linked 二抗（批号G1421、G1526）购自美国Santa Cruz 公司。

2 实验方法

2.1 N87/PTX 构建和细胞培养 采用逐渐增加PTX浓度，间歇诱导的方法构建N87/PTX 细胞。N87 和N87/PTX 细胞以DMEM 全培养基（含10%FBS 和1%青-链霉素）进行培养。培养环境为37 ℃，含5%CO2的无菌环境。

2.2 转染miR-103 inhibitor 抑制内源性miR-103将N87/PTX 细胞接种于6 孔板，培养过夜。次日，将10 μL miR-103 抑制物（inhibitor）和阴性对照（NC）分别用 DMEM 高糖培养基稀释 50 倍。将Lipofectamine 2000 稀释300 倍。分别吸取miR-103 inhibitor 0.5 mL 和Lipofectamine 2000 稀释液1.5 mL 混合并静置20 min。将细胞培养基更换为上述混合液，置于培养箱培养24 h。将转染miR-103 inhibitor 和NC 的N87/PTX 细胞分别设为miR-103 inhibitor 组和NC 组，同时以未转染的N87/PTX 细胞作为空白对照组（Control）。

2.3 MTT 法检测细胞活力 N87 或N87/PTX 细胞以每孔9×103个接种于96 孔板，以PTX（0、0.01、0.1、1、10、100、1000 μmol/L）处理48 h，每个浓度设置5个重复孔。48 h 时每孔直接加入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL）处理4 h，而后每孔加入二甲基亚砜100 μL，用酶标仪（490 nm）检测吸光度并计算细胞活力，根据细胞活力计算各细胞IC50。实验重复3 次。耐药指数=N87/PTX 细胞IC50 均值/N87 细胞IC50 均值。

2.4 RT-qPCR 检测miR-103 表达水平 取对数期所需细胞接种于96 孔板，当细胞生长至80%汇合度时以TRIZOL 法提取细胞总RNA。按说明书以逆转录聚合酶链式反应试剂盒进行逆转录反应得到cDNA。稀释cDNA 和引物。以U6 为内参，用RT-试剂盒在ABI 7500 型RT-qPCR 系统中进行检测。实验重复3 次，以2-△△Ct法计算miR-103 的表达水平。miR-103 上游引物：5′-AGCAGCATTGTACAGGGCTATCA-3′，下游引物：5′-GCCGTCGGTGATGCTTTTTTGG-3′。U6 上游引物，5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

2.5 结晶紫染色 取对数期细胞接种于6 孔板中，细胞生长至60%汇合度时按需求加入PTX（3 μmol/L）处理48 h。PBS 洗涤，加入4%多聚甲醛固定10min。PBS 洗涤，每孔加入2 mL 结晶紫染液染色10 min。清水洗涤，于倒置显微镜下观察拍照，随机记录3 个视野细胞数目，计算细胞贴壁存活率。

2.6 miR-103 的靶基因预测 以miRcode 网站（http://www.mircode.org/）分析miR-103 与IKBα 的编码基因NFKBIA 结合的可能性。同时在RNA22 v2 microRNA target detection 网站（https://cm.jefferson.edu/rna22/Interactive）预测二者结合的潜在位点。

2.7 蛋白印迹法检测p-NF-κB p65、MGMT 及IKBα 蛋白表达 提前配制含蛋白抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA 细胞裂解液，置于冰上备用。将所需检测细胞以PBS 洗两遍，第二遍保留PBS，用蛋白刮刀刮下细胞并转移至1.5 mL EP 管中，4 ℃、800 g 离心5 min，弃去上清液并用吸水纸吸干水分，各加入100 μL 裂解液于冰上裂解15 min，4 ℃、8500 g 离心20 min，上清液即为提取总蛋白，总蛋白经BCA 蛋白定量试剂盒定量后制备成蛋白样品。以每孔道30 μg/10 μL 蛋白样品进行电泳，随后将蛋白转印至PVDF 膜上。PVDF 膜以5%脱脂奶粉封闭过夜。次日加入NF-κB p65、p-NF-κB p65、IKBα、MGMT 及GAPDH 抗体避光孵育4 h。TBST 洗膜后，加入抗鼠和抗兔IgG，HRP-linked 二抗室温避光孵育1 h，PVDF 膜以TBST 清洗后用ECL 化学发光试剂盒进行显色，凝胶成像仪进行曝光。

2.8 免疫荧光法检测NF-κB p65 细胞分布 将细胞铺在盖玻片上，24 h 后于冰上用预冷的甲醇固定20 min。然后用0.1% Triton X-100 对细胞进行通透处理，室温条件下用3% BSA 封闭30 min。将细胞与NF-κB p65 抗体（1∶500）室温孵育2 h。PBST 洗涤后，细胞与荧光二抗（1∶1000）孵育2 h。在室温下用0.5 μg/mL 的DAPI 孵育10 min。于倒置荧光显微镜下观察拍照。

2.9 统计学方法 应用Graphpad prism 7.0 统计软件对实验结果进行分析处理。数据用Shapiro-Wilk进行正态性检验，均为正态分布，以均数±标准差（）表示，组内两样本均数比较用t 检验，多样本均数比较采用单因素方差分析，两两多重比较采用LSD-t 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 miR-103 在N87/PTX 表达上调 MTT 结果显示，PTX 对N87 和N87/PTX细胞的IC50分别为（1.5±0.2）和（40.6±4.5）μmol/L，经计算N87/PTX 耐药指数为27.1。RT-qPCR结果显示，N87细胞和N87/PTX 细胞miR-103 表达水平分别为（0.9±0.1）和（10.7±0.9），与N87 细胞比较，N87/PTX 细胞miR-103 表达水平显著升高（P＜0.01）。

3.2 抑制miR-103 影响PTX 对N87/PTX 细胞的细胞毒作用 MTT 结果显示，PTX 对Control、NC 及miR-103 inhibitor 组N87/PTX 细胞的IC50 分别为（43.5±4.8）、（41.7±4.5）及（3.3±0.3）μmol/L。与NC 组比较，miR-103 inhibitor 组IC50 显著降低（P＜0.01）。

3.3 抑制miR-103 影响N87/PTX 细胞对PTX 的敏感性 结晶紫染色结果显示，PTX（3 μmol/L）对Control 组N87/PTX 细胞存活能力有一定影响。Control+PTX 和NC+PTX 组细胞存活率无明显差异。与NC+PTX 组比较，miR-103 inhibitor+PTX 组N87/PTX 细胞存活率显著降低（P＜0.01），见图1 和表1。

表1 PTX 处理后各组N87/PTX 细胞存活率比较（%，）

表1 PTX 处理后各组N87/PTX 细胞存活率比较（%，）

注：Control 为空白对照；NC 为阴性对照；miR-103 inhibitor 为miR-103 抑制物；PTX 为紫杉醇；Solvent 为溶媒；与Control+Solvent 比较，aP＜0.01；与NC+PTX 比较，bP＜0.01

3.4 NFKBIA 基因（IKBα 蛋白的编码基因）可能是miR-103 的靶基因 RNA22 v2 和miRcode 软件分析结果显示，IKBα 的编码基因NFKBIA 与miR-103存在互补结合位点，可能是后者的靶基因，二者结合位点序列见表2。

表2 miR-103 与NFKBIA 基因的结合序列

3.5 p-NF-κB p65、IKBα 及MGMT 蛋白在N87/PTX 细胞的表达 蛋白印记结果显示，相较于N87细胞，N87/PTX 细胞IKBα 蛋白表达明显下调，p-NF-κB p65 和MGMT 蛋白表达显著上调（P＜0.01），见图2 和表3。

表3 N87/PTX 细胞p-NF-κB p65、IKBα 及MGMT相对蛋白表达量比较（%，）

表3 N87/PTX 细胞p-NF-κB p65、IKBα 及MGMT相对蛋白表达量比较（%，）

注：N87 为正常培养的N87 细胞；N87/PTX 为PTX 耐药N87 细胞；N87 为正常培养的N87 细胞；N87/PTX 为PTX 耐药N87 细胞；IKBα为核因子κB 抑制蛋白α；MGMT 为O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶；与N87 比较，aP＜0.01

3.6 miR-103 对p-NF-κB p65、IKBα 和MGMT 蛋白表达的影响 蛋白印记结果显示，NC 和Control组N87/PTX 细胞p-NF-κB p65、IKBα 及MGMT 蛋白表达无明显差异。与NC 组比较，miR-103 inhibitor 组N87/PTX 细胞p-NF-κBp65 和MGMT 蛋白表达显著下调，IKBα 蛋白表达明显上调（P＜0.01），见图3 和表4。

表4 各组细胞p-NF-κB p65、IKBα 及MGMT相对蛋白表达量比较（%，）

表4 各组细胞p-NF-κB p65、IKBα 及MGMT相对蛋白表达量比较（%，）

注：Control 为空白对照；NC 为阴性对照；miR-103 inhibitor 为miR-103 抑制物；p-NF-κB p65 为磷酸化型NF-κB p65；IKBα 为核因子κB 抑制蛋白α；MGMT 为O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶；与NC组比较，aP＜0.01

3.7 miR-103 对NF-κB p65 核质分布的影响 免疫荧光结果显示，Control 和NC 组N87/PTX 细胞NF-κB p65 分布于细胞核和细胞质中。相较于NC组，miR-103 inhibitor 组N87/PTX 细胞NF-κB p65主要表达于细胞质，而在细胞核内表达明显减少，见图4。

4 讨论

miR-103 作为miRNA 家族成员，已显示与恶性肿瘤化疗耐药有关。一项关于肺癌的研究发现，miR-103 可靶向PTEN 激活PI3K/AKT 信号通路，从而促进肺癌细胞A549 对达沙替尼耐药[5]。研究显示，miR-103 能通过调节COP1 诱导人白血病细胞对阿霉素耐药[10]。本研究成功构建PTX 耐药胃癌细胞N87/PTX，并发现miR-103 在N87/PTX 细胞中表达升高。进一步研究发现，miR-103 inhibitor 处理即可降低PTX 对N87/PTX 细胞的IC50，还可抑制N87/PTX 细胞的贴壁存活能力。提示miR-103 可能与N87/PTX细胞PTX 耐药相关。通过生物学信息学分析发现，IKBα 蛋白的编码基因NFKBIA 与miR-103 存在互补结合位点，NFKBIA 可能是miR-103 的靶基因。提示miR-103 对胃癌细胞PTX 耐药的影响可能与IKBα 相关。在经典的NF-κB 通路中，IKB 能结合NF-κB 而抑制后者活性，而其自身降解可活化NFκB。在过去的研究中，NF-κB 已被证明在卵巢癌[7]、乳腺癌[12]及黑色素瘤[13]等恶性肿瘤化疗药物耐药中发挥作用。在本研究中，N87/PTX 细胞IKBα 蛋白表达下调，p-NF-κB p65 蛋白表达上调。提示miR-103可能通过靶向抑制IKBα 蛋白表达，从而磷酸化激活NF-κB p65 蛋白。

为了进一步进行验证，本研究采用miR-103 抑制物miR-103 inhibitor 抑制N87/PTX 细胞内源性miR-103 活性表达。结果发现，miR-103 inhibitor 可诱导N87/PTX 细胞IKBα 蛋白表达上调，p-NF-κB p65 蛋白表达下调。免疫荧光实验发现，miR-103 inhibitor 处理后N87/PTX 细胞核NF-κB p65 表达明显减少。通常情况下，NF-κB 磷酸化激活后通过转位至细胞核内与其相关的DNA 基序结合，从而诱导靶基因的转录[7-8，13]。这些提示，在本研究中，miR-103 可能通过靶向抑制IKBα 蛋白表达，从而磷酸化激活NF-κB p65 蛋白，后者进入细胞核参与转录调控。

MGMT 是NF-κB 参与恶性肿瘤细胞耐药的重要下游信号分子，能与DNA 鸟嘌呤6 位氧上的烷基化合物结合，将烷基转移到MGMT 的第145 号半胱胺酸活性位点上，使DNA 上烷基化的鸟嘌呤被还原，最终避免子链DNA 缺口出现，导致细胞耐药[9，14]。本研究中N87/PTX 细胞MGMT 蛋白表达上调，提示N87/PTX 细胞耐PTX 效应可能与NF-κB 通路介导MGMT 蛋白表达上调有关。进一步实验发现，miR-103 inhibitor 还可诱导N87/PTX 细胞MGMT 蛋白表达下调，提示miR-103 可能通过NF-κB 通路介导MGMT 蛋白表达上调。

综上所述，miR-103 可能通过靶向抑制IKBα 蛋白表达而促进NF-κB p65 磷酸化进入细胞核，而后者通过调节MGMT 的转录表达，最终介导胃癌细胞PTX 耐药。