猪ACSM3 基因过表达/敲减质粒的构建

张冬杰，柳樱子，汪 亮，杨秀芹，刘 娣*

(1. 黑龙江省农业科学院畜牧研究所，哈尔滨 150086；2. 农业农村部种养结合重点实验室，哈尔滨 150086；3. 东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150006)

过去几十年，养猪业主要把提高生产效率和瘦肉率作为优先考虑因素，导致胴体和肌肉中储存的脂肪量持续下降[1]。肌内脂肪的数量和组成是决定肉质和消费者接受程度的重要因素，因为适当的肌内脂肪含量可增加猪肉的风味、嫩度和多汁性等感官特性。已知饲粮和饲养方式可改善肌肉品质和肌内脂肪分布[2-3]，品种和基因也会影响动物的脂肪分布和脂肪酸组成[4]，同一个体不同部位的脂肪酸含量也会存在显著不同[5]。民猪是我国著名的地方品种之一，肌内脂肪含量可达3%～4%，远高于引进的大白猪[6]。本课题组在前期研究中发现，酰基辅酶A 合成酶中链家族成员3（Acyl-CoA medium-chain synthetase 3，ACSM3）高表达于民猪的背最长肌内（与腿肌相比）[7]。ACSM3 是一种酰基辅酶A 合成酶，直接参与脂肪酸的代谢，负责油脂分解产生的脂肪酸和脂肪族一元羧酸的化学反应和代谢途径。在内洛尔牛的背最长肌内，ACSM3 基因高表达于脂肪酸含量偏低个体的多不饱和脂肪酸（PUFA）、饱和脂肪酸（SFA）和ω-3 多不饱和脂肪酸内，低表达于单不饱和脂肪酸(MUFA)内[8]。因此，本研究拟通过分子生物学技术，人为构建ACSM3 基因的过表达和敲减质粒，为后续该基因的生物学功能研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

20 日龄仔猪1 头，由黑龙江省农科院畜牧研究所民猪保种场提供，KpnI 和EcoR I 内切酶、pcDNA3.1(+)载体、荧光定量试剂等主要购自宝生物工程（大连）有限公司，反转录试剂盒（AT341-01）购自全式金，siRNA 干扰序列由金开瑞公司设计并合成，脂质体2000、PBS、DMEM/F12 培养基等主要购自Invitrogen。

1.2 方法

1.2.1 猪ACSM3 基因完整编码区的扩增 根据NCBI 网站上已提交的猪ACSM3 基因序列（XM_021086514.1）设计1 对引物（F/R）用于扩增其完整编码区序列，并在上游引物5′端引入KpnI酶切位点，下游引物5′端引入EcoR I 酶切位点，引物序列信息如下，F: 5′-GGTACCTTAAATTTTTTT C CATTCCTTCTTC-3′，R: 5′- GAATTCTACCATG CAGATATTACTTTG-3′，划线部分为引入的酶切位点。以猪脂肪组织的cDNA 为模板，F/R 为特异性引物进行常规PCR 反应。反应结束后，1%琼脂糖凝胶电泳检测，利用胶回收试剂盒回收目的片段，连入pMD-18T 载体后送交吉林库美生物科技有限公司测序。

1.2.2 pcDNA3.1-ACSM3 真核表达载体的构建 将测序正确的pMD-18T-ACSM3 质粒利用KpnI 和EcoR I 两种内切酶将插入的片段切下，通过胶回收纯化后连入pcDNA3.1(+)载体，构建pcDNA3.1-ACSM3 重组质粒，再次送交吉林库美生物科技有限公司测序，以保证插入序列的准确性。

1.2.3 猪ACSM3 基因干扰序列设计与合成 本研究共设计特异性干扰序列3 条，分别为p-siRNA- 1：5′-CCAUGAAACAGAACUUCAATT-3′，p-siRNA-2：5′-CCAAGGAGCAUGUGUAUUUTT-3′，p-siRNA-3：5′- GCAUUCGAGUUUCACCUA ATT-3′，用于敲减脂肪细胞内ACSM3 的表达。

1.2.4 猪前脂肪细胞的体外培养与诱导分化 无菌采集20 d 仔猪颈背部脂肪组织，去掉多余的结缔组织后转移到37 ℃预热的D-PBS 中（含有2 倍培养浓度的双抗），用手术剪将脂肪组织剪成大小约2 cm³的小块，转入75 %酒精中浸泡40 s，再用D-PBS冲洗2 次去除残余酒精。将冲洗干净的脂肪组织放入5 mL 无菌离心管中，剪成糜状后转入50 mL 无菌离心管中，加入2 倍体积的消化液（DMEF/F12培养基，含终浓度0.1 %的I 型胶原酶、终浓度2 %的牛血清白蛋白及终浓度10 mmol·L-1CaCl2），37 ℃消化摇床中130 r·min-1，消化1 h。消化后加入等体积的完全培养基（10 % FBS 的DMEM/F12培养基）终止消化，150 目细胞筛过滤，滤液经1 000 r·min-1离心10 min，弃上清。将沉淀用完全培养基重悬，1 000 r·min-1离心5 min 后弃上清，再清洗1次后，用4 mL 完全培养基重悬沉淀，然后均匀地铺于60 mm 细胞培养皿中，放入含终浓度5 %二氧化碳的细胞培养箱中培养。待细胞密度达到80 %后传代培养。

前脂肪细胞的诱导分化：待细胞密度达到90 %以上，更换为成脂分化培养基（完全培养基中含终浓度10 μg/mL 胰岛素、1 μmol·L-1地塞米松 、0.125 mmol·L-1吲哚美辛、0.5 mmol·L-13-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1 nmol·L-1三碘甲状腺原氨酸 、1 μmol·L-1罗格列酮）。成脂分化培养2 d 后，更换为只含胰岛素、罗格列酮和三碘甲状腺原氨酸的完全培养基，继续培养4～6 d，每2 天换1 次培养液。

1.2.5 转染 转染前将脂肪细胞接种到6 孔细胞培养板中，待细胞密度达到80%～90 %的汇合度时开始转染。将2.5 µg 的质粒、10 µL 的脂质体2000 分别加入到100 µL DMEM/F12 培养基中，充分混匀，再将二者混在一起室温孵育5 min。弃掉待转染细胞的培养基，D-PBS 清洗1 次，每孔补加DMEM培养基1.8 mL，将孵育好的质粒-转染试剂复合物加入到细胞培养板中，轻轻摇晃，置于37 ℃，5 % CO2饱和湿度的培养箱中。4～6 h 后更换为含血清的完全培养基，继续培养以备后续实验。转染质粒pcDNA3.1-ACSM3 时，以转染空载体pcDNA3.1（+）的细胞为对照。转染p-siRNA-ACSM3 时，以转染siRNA-NC 的细胞为对照组。siRNA 的转染参照金开瑞（武汉）siRNA 使用说明操作。

1.2.6 细胞RNA 的提取与反转录 分别在前脂肪细胞诱导分化的第2 天和第8 天提取细胞总RNA。采用常规Trizol 法提取总RNA。

按照反转录试剂盒说明书操作，反应体系为总RNA 1 µg，All-in-One SuperMix 4 μL，gDNA Remover 1 μL，RNase-free H2O 补至20 μL。反应条件为42 ℃15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 1 min，将所提取的RNA反转录为cDNA，-20℃保存备用。

1.2.7 实时定量PCR 利用LightCycler480Ⅱ荧光定量PCR 仪（Roche）对目的基因进行定量检测，反应体系为cDNA 0.5 μL，2×SYBR Green PCR Mixture 10 μL，引物各0.5 μL，灭菌水补充至20 μL。反应程序为95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 个循环。每组试验重复3 次，测定结果根据2-ΔΔCT法计算各模板中目的基因相对于内参基因GAPDH的表达量，利用SPSS 17.0 进行单因素方差分析及LSD 检验。

2 结果与分析

2.1 猪ACSM3 基因真核表达载体的构建

以民猪脂肪组织的cDNA 为模板，扩增得到猪ACSM3基因完整编码区序列，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，在1 000～2 000 bp 间出现单一条带，与预期的1 746 bp 大小相符（图1(A)），测序结果也证明该片段长 1 746 bp。构建的pMD18-T-ACSM3 质粒经KpnI 和EcoR I 双酶切后，将目的片段连入pcDNA3.1(+)真核表达载体，对重组质粒pcDNA3.1-ACSM3 进行双酶切鉴定后，发现所切下片段大小与目的片段大小一致，说明目的片段实现了正确插入（图1(B)）。

2.2 猪ACSM3 基因干扰序列的筛选结果

以转染随机序列的p-siRNA-NC 的细胞为对照，与转染了3 条特异序列的细胞进行比较，筛选有效敲减ACSM3 的干扰序列。结果发现，与对照组相比，干扰序列2 的敲减效果最显著，故选择p-siRNA-2 进行后续实验，并命名为 p-siRNAACSM3。

2.3 猪ACSM3 基因的过表达检测结果

将真核表达载体 pcDNA3.1(+)和重组质粒pcDNA3.1-ACSM3 分别转染到猪前脂肪细胞中，在转染后的第2 天和第8 天收集细胞，检测细胞中ACSM3基因表达情况，以GAPDH为内参。结果（图3）显示，重组质粒在转染2 d 后，脂肪细胞内ACSM3 的表达量显著升高，转染8 d 后的表达量与2 d 后的表达量比较，发生了显著下降，但仍显著高于对照组。

2.4 猪ACSM3 基因的敲减效果检测结果

以转染p-siRNA-NC 的细胞为对照，分别在转染后的第 2 天和第 8 天收集细胞，检测转染p-siRNA-ACSM3敲减质粒后ACSM3 基因的表达变化情况。结果发现，转染2 d 后，ACSM3 基因的表达量出现了显著下降；但在转染8 d 后，ACSM3 基因的表达量与对照组相比已无明显差异（图4）。

3 讨论

脂肪的沉积包括脂肪细胞的增殖、分化和凋亡等过程，该过程受到多种转录因子和脂肪分泌因子的级联调控，研究这些因子对肌内前体脂肪细胞增殖分化的作用及其机制对猪肉的品质改良具有重要的现实意义。本课题组在对民猪背最长肌和腿肌差异表达基因的筛选中，发现了一个在背最长肌内高表达的ACSM3 基因，该基因具有酰基辅酶A 合成酶活性，可以通过与线粒体外膜上的中链脂肪酸相互作用产生酰基辅酶A，这是脂肪酸代谢的第一步[9]。据此推测，该基因的高表达会促进脂肪组织的脂解作用。

已有研究表明，ACSM3 的过度表达会抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭，负调控整合素b1/AKT 信号通路（Integrin b1/AKT pathway）[10]；当ACSM3下调表达时，TGFβ、WNT、AKT 和MYC 信号通路会被激活[11]。丁酸可以显著上调ACSM3 基因的表达[12]；而PPARγ则会抑制其表达。ACSM3 在南极磷虾油调节脂代谢中起着重要的调控作用[13]。该基因通过线粒体脂肪酸β 氧化参与脂质代谢，同时也是PPARα 信号通路的一部分[14]。

本研究构建的ACSM3 基因过表达载体，虽然是瞬时转染，靶基因并没有整合到基因组中，但通过检测发现，即使到第8 天，ACSM3 基因的过表达效果依旧显著存在。但敲减质粒的作用效果远不如过表达质粒持续的时间久，干扰质粒转染后的第2 天，ACSM3 基因敲减效果显著，此时前脂肪细胞的增殖期基本结束，开始进入分化期。但在转染的第8 天检测时，基因的敲减效果与对照组相比，已经无显著差异了，这说明干扰质粒的作用时间有限，如果想对分化期ACSM3 基因的生物学功能进行分析，需要考虑使用CRISPR/Cas9 等基因编辑技术，以实现持久的基因功能缺失。