西伯利亚白刺NsCBL2 基因克隆及表达分析

燕 青，王 爽，张 洋，黄安瀛，那冬晨

（1. 山西师范大学生命科学学院，临汾 041000；2. 中国热带农业科学院湛江实验站，湛江 524091；3. 东北林业大学林学院，哈尔滨 150040；4. 国家林业和草原局盐碱地中心，北京 100091；5. 中国林业科学研究院速生树木研究所，湛江 524022)

植物不能像动物一样通过移动来避免不良环境，因此在进化过程中形成极为复杂的胁迫响应机制。Ca2+作为植物中普遍存在的第二信使，在植物响应各种胁迫时发挥不可或缺的作用[1]。当植物受到外界胁迫刺激时，胞质内钙离子浓度迅速增加，游离的钙离子与钙感受器蛋白结合将信号传送给下游靶蛋白，常见的钙感受器-类钙调磷酸酶B 样蛋白（calcineurin B like protein，CBL）被证实在多种非生物胁迫的调控中发挥重要作用，它通过与其互作蛋白丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（CBL interacting protein kinase，CIPK）结合对靶蛋白进行调控，进而激活胁迫响应机制[2-4]。

已有多项研究表明CBL家族成员在各类非生物胁迫中起着重要作用，调控方式涉及CBL 和CIPK之间的互作，靶蛋白磷酸化及Ca-ROS 调节等[5-6]。作为研究最广泛的钙调家族之一，CBL家族的研究在拟南芥（Arabidopsis thaliana，10 个）[7]、水稻（Oryza sativa，10 个）[7]、玉米（Zea may，12 个）[8]、毛果杨（Populus trichocarpa，10 个）[9]、菠萝（Ananas comosus，8 个）[10]、葡萄（Vitis vinifera）[11]和胡杨（Populus euphratica，10 个）[12]等植物中均有报道。

近年来，关于CBL基因在不同植物中的耐盐耐碱抗旱等非生物胁迫的研究较多，例如：拟南芥中的AtCBL1在耐盐与耐旱中发挥重要作用，过表达能显著提升其耐盐与耐旱能力[13]；菠萝AcCBL1基因在拟南芥中异源表达提高了拟南芥的耐盐与抗渗透压水平，同时也加强了应对真菌胁迫的能力[10]；毛果杨PtCBL10基因在K+离子调控中发挥重要作用，过表达可提升毛果杨耐盐性并增强其离子平衡能力的调控[14]。玉米ZmCBL9提升了转基因拟南芥应对ABA、葡萄糖、盐及渗透压等胁迫的能力[8]。拟南芥的 AtCBL2 蛋白通过调控液泡上的H+-ATPase 蛋白对胞质中的离子平衡进行调控，从而增加植株应对离子胁迫（盐、碱等）的能力[15-16]。

西伯利亚白刺（Nitraria sibirica）是我国8 个白刺种之一，为典型稀盐型盐生植物，可在含盐量高于15 g·kg-1的重盐碱地正常生长，对恶劣生境有极强的适应能力，是研究植物耐盐分子机制、挖掘耐盐抗逆等基因资源及改良土壤的重要材料[17-18]。本研究以西伯利亚白刺为试验材料，对其NsCBL2基因进行克隆分析并研究其在盐、碱、旱胁迫下的表达情况，以期为解析西伯利亚白刺响应非生物胁迫的分子机制提供基础。

1 材料与方法

1.1 西伯利亚白刺RNA 的提取及cDNA 的合成

西伯利亚白刺选自中国林业科学研究院天津林业科学研究所培育的耐盐性优良母株，采用组织培养方法扩繁后，在25 ℃、长日照（光照16 h；黑暗8 h；光照强度：120 μmol·m-2·s-1）温室中培养3 周后，选择生长势相似组培苗进行处理，盐、碱及干旱胁迫分别用400 mmol·L-1NaCl、400 mmol·L-1NaHCO3及300 mmol·L-1甘露醇（Mannitol）处理不同时间，取材后液氮中研磨。利用擎科生物科技有限公司的多糖多酚植物总RNA 提取试剂盒（货号：TSP412）提取西伯利亚白刺总RNA，Takara 公司的PrimeScript™ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（货号：6110A）反转录获得cDNA，放置于-20 ℃冰箱内保存备用。

1.2 西伯利亚NsCBL2 基因的克隆

本研究所用NsCBL2序列来自转录组数据，NCBI 登录号为GSE113246，详细处理、取样及测序方式等参数参考本课题组前期研究文献[19]。使用Primer 5 设计特异性引物，由擎科生物科技有限公司合成引物NsCBL2-F/R（表1），Tm值为（60 ±0.5）℃。使用东洋纺生物科技有限公司的KOD FX Neo 试剂盒克隆基因，利用 OMEGA 公司的E.Z.N.A.® Gel Extraction Kit 试剂盒对PCR 扩增产物进行胶回收。回收产物连接至 pEASY-Blunt 载体，热激法转化大肠杆菌并涂平板，次日挑取单克隆摇菌送至擎科测序，结果正确即使用E.Z.N.A.®Plasmid Maxi Kit OMEGA 试剂盒提取质粒。

表1 试验所用引物序列Table 1 The sequences of primers used in this study

1.3 NsCBL2 基因的理化性质与结构分析

利用NCBI 中的CD-search (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/ wrpsb. cgi)预测NsCBL2的保守结构域；使用ExPaSy 在线程序Protparam（https://web.expasy.org/cgi-bin/ protparam） 分析蛋白理化性质。采用 SignalP（http:// www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP）进行蛋白信号肽预测；通过TMHMM（http://www. cbs.dtu.dk/services /TMHMM/）进行蛋白跨膜结构域预测；使用在线程序SOPMA（https ://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin /secpred sopma .pl）进行蛋白质二级结构分析；利用在线工具swissmodel（http://swissmodel. expasy.org/）进行三级结构预测；使用Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu. cn）在线软件进行亚细胞定位预测。通过Mega6.0 中的邻接法进行系统发育进化树构建；氨基酸多序列比对使用BioEdit 进行。

1.4 西伯利亚白刺NsCBL2 基因的亚细胞定位

使用BioEdit 软件对NsCBL2的CDS 序列进行酶切位点分析，结合pFGC5941-GFP 载体，上下游均选用BamH I 酶切位点，设计载体单酶切扩增引物pFGC5941-GFP-NsCBL2-F/R。以测序正确的NsCBL2阳性质粒为模板扩增pFGC5941-GFP-NsCBL2目的片段，Trelief™ SoSoo Cloning Kit Ver.2 试剂盒将单酶切成功的pFGC5941-GFP 载体与目的片段连接。热激法转化完成后送测序，测序正确后扩大培养提取质粒。采用冻融法将pFGC5941-GFP-NsCBL2转入农杆菌GV3101，将重悬农杆菌液注射到本氏烟草叶片背面，培养箱培养2 d 后，采用激光共聚焦显微镜观察。

1.5 西伯利亚白刺NsCBL2 基因不同非生物胁迫下的表达分析

选取生长3 周且长势一致的西伯利亚白刺组培苗，分组进行盐、碱及干旱处理，处理浓度与1.1 部分相同，由预试验确定。然后分别提取0、1、3、6、12 和24 h 共6 个时段不同处理下的各处理组根、茎和叶组织RNA[20]。根据Takara 试剂盒PrimeScript™RT reagent Kit (Perfect Real Time)试剂盒，将处理后的根、茎、叶的总RNA 分别反转录为cDNA 作为qPCR 模板。利用TransStart Top Green qPCR SuperMix（全式金）试剂盒进行 RT-qPCR，测试仪器为MJ MiniTM personal thermal cycler（BIO-RAD）Real-time PCR，每个样品进行3～6 次生物学重复，选用Actin基因作为内参[20]，依据2-ΔΔCT的方法[22]计算基因的相对表达量。特异序列设计上下游定量引物序列见表1，Tm值均为（60±0.5）℃，利用SPSS对数据结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 西伯利亚白刺NsCBL2 基因的克隆

以西伯利亚白刺全株cDNA 为模板，利用特异性引物对目的片段进行PCR 扩增，获得与预期条带大小相似的克隆片段(图1)。阳性克隆送测结果表明，克隆获得与目标片段完全一致的基因片段。

2.2 西伯利亚白刺NsCBL2 序列的参数分析

2.2.1NsCBL2基因编码氨基酸的理化性质分析

生物信息学分析结果表明NsCBL2包括3 672 个原子，分子式为C1179H1832N298O356S7，相对分子质量为26.10 kDa。编码氨基酸全长为226 aa，在118～594 bp 处含有结构保守域，包含159 个氨基酸（图2）。组成蛋白的氨基酸中，亮氨酸(Leu)所占比例最高，为11.9%，色氨酸(Trp)所占比例最低，占0.4%，不含硒半胱氨酸(Sec)和吡咯赖氨酸(Pyl)。该蛋白等电点为4.82，不稳定系数为44.75，平均亲水系数为-0.246，脂肪指数为92.3，推测该蛋白为不稳定亲水的酸性蛋白。亚细胞定位预测显示基因定位于细胞膜上。

2.2.2 NsCBL2 二级结构及三级结构预测 通过在线预测蛋白的二级（图3）与三级（图4）结构，发现 NsCBL2 蛋白的二级结构主要是由 α-螺旋(51.77%)、无规则卷曲(33.19%)、延伸链(7.96%)和β-折叠(7.08%)组成。对蛋白进行预测没有发现信号肽存在，不存在典型的跨膜螺旋区的非跨膜蛋白。

2.2.3 NsCBL2 氨基酸序列的同源性比对和系统进化分析 通过MEGA.7 将NsCBL2 与拟南芥与水稻的全家族CBL 蛋白序列进行比对，构建系统发育进化树。结果（图5）显示，除OsCBL2 外，这些蛋白序列均含有5 个保守基序，其中与NsCBL2同源度高的基因为AtCBL2与AtCBL3，推测NsCBL2基因功能可能与这两个基因在某些方面具有相似功能。用Bioedit 软件，对NsCBL2 与其他蛋白进行氨基酸比对分析，结果（图6）显示它们均含有5 个保守基序，其中包含4 个CBL家族特有的EF-hands保守区域，均为典型CBL家族蛋白。

2.3 西伯利亚白刺NsCBL2 的亚细胞定位

软件预测NsCBL2 蛋白定位在细胞膜上，后通过注射本氏烟草的方法对NsCBL2基因进行亚细胞定位分析。结果（图7）显示，NsCBL2 定位于细胞膜及液泡膜上。

2.4 西伯利亚白刺不同胁迫下的表达分析

为了研究西伯利亚白刺NsCBL2在不同胁迫条件下的表达情况，分别以400 mmol·L-1NaCl、400 mmol·L-1的NaHCO3及300 mmol·L-1甘露醇模拟盐、碱及干旱胁迫。本研究以Actin为内参基因，根据NsCBL2基因序列设计qCBL2-F/R 荧光引物，利用实时荧光定量PCR 技术进行检测，分别以根茎叶自身0 h 的表达量为对照，值为1。

结果显示，3 种不同胁迫处理下，NsCBL2基因在不同组织的表达量发生了变化，整体呈先降低后升高后再降低的趋势。盐处理（图8）与碱处理（图9）下在叶部出现相对表达量最大值，其中盐处理下相对表达量变化最为显著。模拟干旱处理下（图10），NsCBL2相对表达量变化程度较小，最高点出现在茎部。

3 讨论与结论

植物生长中会不可避免的遭受到各种胁迫，而植物本身无法移动，只能通过自身的防御机制来抵御外界胁迫。近年来，已有多项研究表明，在植物对盐、碱、寒、旱、重金属等非生物胁迫的反馈机制中，CBL 蛋白发挥了重要的调控作用。

本研究克隆获得NsCBL2基因，全长681 bp，编码226 个氨基酸，为酸性不稳定亲水蛋白。氨基酸保守结构中，包含有FRQ 保守结构域，是CBL特有的EF-hand 超家族，该结构包含3 个典型的EF-hand（12 个氨基酸）结构和一个非典型的EF-hand（14 个氨基酸），该结构是接收Ca2+信号的动态变化并向下传导的关键区域[1-2]。系统发育进化树显示其与拟南芥AtCBL2（AT5G55990）及AtCBL3（AT4G26570）的进化关系最近，初步推测这3 个基因在功能方面可能有相似之处。此外，拟南芥中AtCBL2编码的蛋白定位于细胞膜及液泡膜上[23-24]。本研究中亚细胞定位结果与拟南芥中完全相同，推测该基因与拟南芥的AtCBL2基因作用位置也相似。

模拟盐、碱及干旱胁迫下，NsCBL2基因表达量有明显变化，其中盐胁迫与碱胁迫下相对表达量变化大，最高点出现在叶部；干旱胁迫下相对表达量变化较小，最高点出现在茎部。当盐胁迫产生时，拟南芥AtCBL2与AtCBL3通过调节V-ATPase（H+-ATPase）活性来控制植物的生长和离子稳态[25]。盐胁迫及碱胁迫又可分为离子胁迫及渗透压胁迫，渗透压胁迫与干旱胁迫所造成的危害相似均是导致植物缺水[26]。本研究中西伯利亚白刺NsCBL2在应对渗透压（干旱）胁迫时并无显著差异，却被NaCl 及NaHCO3明显诱导，表明该基因在应对盐胁迫与碱胁迫时可能与AtCBL2及AtCBL3相同，通过控制液泡上H+-ATPase 蛋白将离子导入液泡中，从而避免累积的Na+产生离子毒性，对植株造成危害。

本研究初步证明NsCBL2对盐胁迫及碱胁迫具有一定的调控能力，目前已成功构建过表达载体与抑制表达载体，后续将对该基因在转基因植物中的作用与调控机制进行具体研究。研究表明NsCBL2基因可能在西伯利亚白刺中发挥与拟南芥中相似的作用，后续研究可从这一方面着手进行。本研究结果可为进一步研究西伯利亚白刺抗逆分子机制提供理论依据与数据支撑。