基于气相色谱-质谱联用技术及网络药理学的黑老虎根挥发油活性成分研究*

马洁瑶，蔡 伟，陈 秧，何 琴

（1.湖南医药学院药学院，湖南 怀化 418000；2.湖南医药学院侗医药研究湖南省重点实验室，湖南 怀化 418000）

黑老虎Kadsura coccinea（Lem.）A.C.Smith属木兰科五味子木质常绿藤本植物，主要分布于江西、湖南、广东、海南等地，在湖南常用作侗药［1］。其药用部位主要为根，有强烈香气有行气活血、消肿止痛功效，常用于治疗胃病、风湿骨痛、跌打瘀痛［2-3］。黑老虎根挥发油（EOKC）含量高，且是黑老虎根活性成分的重要组成部分。挥发油是许多中药材的有效成分，多含脂肪族、芳香族、萜类成分较多，分子量小且脂溶性强，易穿过体内生物膜，生物利用度高，用于疾病防治可快速发挥疗效［4-5］。气相色谱-质谱联用（GC-MS）法具有灵敏度、选择性高和分离能力强等特点，并配备成熟的数据库，可实现挥发性复杂样品的快速分离和鉴定［6-7］。目前网络药理学研究分析大多基于文献或数据库中已有的中药化学成分，不同地域药材成分可能存在差异。在此，采用GC-MS法对EOKC（药材源自湖南省通道侗族自治县）进行快速分离鉴定，并结合网络药理学，利用多种数据库资源整合分析。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 仪器与试药

仪器：Thermo trace1300-ISQ LT型气相色谱-质谱联用仪（美国Thermo Scientific公司）；TG-5MS型色谱柱（美国Thermo Scientific公司；30 m×0.25 mm，0.25 μm；以5%苯基二甲基聚硅氧烷为固定相）。

试药：C7-C30正构烷烃标准品（美国Supelco公司，批号为N#A3469，质量浓度均为1 000 μg/mL）；正己烷、天水硫酸镁均为分析纯，水为纯化水。黑老虎根药材于2020年5月采于湖南省怀化市通道侗族自治县，经湖南医药学院马廷升教授鉴定为正品。

1.2 数据库及软件

PubChem（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound）；中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）；SwissADME（http：//www.swissadme.ch/）；UniProt（https：//www.uniprot.org/）。Cytoscape 3.8.0软件。

1.3 方法

1.3.1 挥发油成分的提取与鉴定

检测条件：初始温度为50℃（保持2 min），以10℃/min的速率升至120℃（保持2 min），再以2℃/min的速率升至160℃，最后以15℃/min的速率升至300℃（保持5 min）；载气为氦气（纯度为99.999%）；载气流速为1 mL/min；进样口温度为280℃；分流比为10∶1。质谱采用电子轰击离子源（EI）；电子能量为70 eV；离子源温度为280℃；传输线温度为250℃；扫描质量范围为40～620 amu。

样品制备及鉴定：取药材样品粉末（过40目筛）50 g，精密称定，置2 000 mL圆底烧瓶，加1 200 mL水，超声（功率200 W，频率40 kHz）处理30 min，按2020年版《中国药典（四部）》通则2204挥发油测定法，回流提取2 h，加入无水硫酸钠干燥，得淡黄色挥发油。取1 μL，加1 mL正己烷稀释后进样检测。采用相同的GC-MS条件检测C7-C30正构烷烃标准品，获得正构烷烃的GC-MS信息。

1.3.2 挥发油成分的筛选及靶标预测

对GC-MS检测的结果使用配套的美国国家标准与技术研究院（NIST 17）库搜索匹配化合物，根据成分出峰和C7-C30正构烷烃标准品峰的保留时间计算保留指数（RI），进一步确证所匹配的化合物［8］。采用峰面积归一化法计算各成分的相对百分含量。选择相对百分含量＞1%的成分，通过PubChem数据库获得化合物结构，将结构导入SwissADME，得到化合物氢键供体数目、相对分子质量、脂水分配系数、氢键受体数目、可旋转键数目等信息，依次判断是否符合类药五原则［9］。运用TCMSP检索化合物已知靶点，UniProt数据库将靶点全部转换为基因，汇总并去除重复基因。

1.3.3 成分-靶点及靶点-靶点相互作用网络构建

采用Cytoscape 3.8.0软件，导入化合物名称和对应预测靶点，构建成分-靶点（C-T）网络，通过C-T图分析预测EOKC主要化学成分的相关分子机制。进一步将靶点基因名称输入Cytoscape的String插件，构建靶点蛋白相互作用（PPI）网络，以获得靶蛋白之间的联系及关键蛋白信息。靶点红色越深表示节点度值越高，节点之间线条越粗代表相关性越高，重要性越大。

1.3.4 靶点富集及疾病分析

使用David数据库分析，使用Cytoscape 3.8.0软件的ClueGO软件作图将数据可视化（圆形越大代表其所占比重越大，越重要），Analysis Mode项选择Functional Analysis，Load Marker List物种选择智人Homo Sapiens，并输入基因名称。ClueGO settings选择基因本体论（GO）功能富集分析、京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，设置P≤0.05，Network Connectivity设置为Medium，即可获得相关靶点基因的GO功能富集［包括生物过程（BP）、分子功能（MF）、细胞组分（CC）］、KEGG通路等信息。采用ClueGO插件整合做出疾病分析结果图。

2 结果

2.1 活性成分的鉴定与筛选

共纳入成分17种，总离子流图见图1，各成分信息见表1，均满足类药五原则。其中，15个成分在TCMSP中能查询到相关靶点信息，纳入网络药理学分析。

图1 总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram

表1 主要化学成分信息Tab.1 Information of main chemical components

2.2 成分-靶点网络构建

共得15个成分，30个靶蛋白，共计45个节点，139条边。其中17个靶点（56.67%）对应2个及以上小分子，充分体现了药物多成分、多靶点、多途径调控疾病的特点。其中PTGS1，PTGS2，GABRA1，GABRA2，GABRA6，CHRM1，CHRM3，SLC6A2为EOKC的主要作用靶点。

2.3 靶蛋白PPI网络构建

PPI网络见图2。共获得162个相互作用关系及28个相关目标。其中SLC6A4，HTR2A，CHRNA7，ADRB2，ADRA1B，ADRA1A，GABRA6，GRIA2，GABRA2，CHRM2，MAOB，TNF，PTGS2，IL-1β，CHRM1等靶蛋白作用突出。ADRB2，TNF，PTGS2，PTGS1，IL-1β是炎症通路的重要靶点，CHRNA7和CHRM1是胆碱能抗炎通路的重要靶点。

图2 靶蛋白相互作用网络图Fig.2 PPI network of targets

2.4 KEGG通路分析

共富集得20条通路（见表2），可视化分析见图3。其中相关性较大的有与精神调节相关的通路，包括神经活性配体-受体相互作用、逆行神经信号、尼古丁上瘾、吗啡上瘾、γ-氨基丁酸（GABA）、5-羟色胺突触通路；与炎症相关的通路，包括核因子（NF）-κB通路，胆碱能抗炎通路。EOKC的成分-靶点-通路网络图见图4。

2.5 GO功能富集分析

结果见表3。主要富集到氨基丁酸信号通路、突触传递、胆碱能过程、离子跨膜运输等BP，细胞外配体门控离子通道活性、GABA-A受体活动、药物结合等MF；以及突触后膜、细胞连接、GABA-A受体复合物CC。

2.6 疾病分析

相关性排名前20的疾病见表4。可见，这些靶点可能与部分精神类疾病，如酒精依赖、情感障碍、自闭症、抑郁症、精神分裂、阿尔茨海默病（AD）等相关，还可能与2型糖尿病、感染、炎症等相关。提示黑老虎根挥发油可能对上述部分疾病有一定治疗作用。

3 讨论

黑老虎药材在侗医药中应用历史悠久，常用于治疗胃及十二指肠溃疡、慢性胃炎、妇科疼痛等症，不同地区用药方法各异。现代药理学研究发现，其有效成分可抗炎、抗氧化、抗肿瘤［10-12］。石焱芳等［13］采用气相气色谱-质谱联用技术检测了两广及福建产黑老虎挥发油成分，结果显示，总挥发油的质量分数广东＞广西＞福建，三者有20种共同的化学成分，主要包括γ-衣兰油烯、β-石竹烯、别香橙烯等。ZHAO等［14］采用气相色谱及气相色谱-质谱联用技术检测出贵阳黑老虎挥发油47种成分，占总成分92.72%，主要包括α-蒎烯、β-蒎烯、莰烯等。本研究结果与其他产地药材挥发油的文献比较存在部分差异，如本研究中含量较高的石竹烯、α-古巴烯、葎草烯等成分在其他产地药材挥发油中虽有检出但含量相对较低，而本研究中检出的γ-杜松烯、γ-古芸烯、β-芹子烯等成分为产地特有成分。这可能与植物在不同的气候、土壤等环境，使挥发油成分在生物合成过程受到不同的影响有关。

表2 KEGG通路富集Tab.2 KEGG pathways enrichment

图3 KEGG通路富集分析可视化图Fig.3 Visualization of KEGG pathways enrichment analysis

EOKC常用于制作精油、涂抹油类产品，用于舒缓颈椎、腰椎、腰痛、腿、手足背酸痛等，本研究结果显示，EOKC活性成分主要通过NF-κB通路（涉及TNF，PTGS2，IL-1β），胆碱能抗炎通路（涉及CHRM3，CHRM2，CHRM1，CHRNA7）发挥抗炎效果。胆碱能抗炎通路是近年来发现的、通过神经免疫调节通路控制机体炎症的通路，与传统的体液抗炎通路相比更迅速、直接，CHRNA7是胆碱能抗炎通路的重要节点［15］。石竹烯作为EOKC中占比最大的成分，可改善关节炎模型大鼠的全身炎症和氧化状态，通过氨基酸和组胺途径抑制细胞因子释放来发挥抗炎作用［16-17］。古巴烯、杜松烯也是EOKC的主要成分，同样是番荔枝科植物挥发油的重要成分。有文献报道，番荔枝科植物挥发油能缓解叉菜胶导致的小鼠腹膜炎和后爪水肿，显示出显著的抗炎特性［18］。以上富集的相关靶点和通路为研究黑老虎药材的抗炎作用提供了思路。

中药挥发油是芳香中药具代表性的有效组分，往往具有抗焦虑、抗抑郁、镇静安神、神经保护作用等药理活性。李慧婷等［19］总结了37种中药材挥发油在抗抑郁、抗癫痫、抗焦虑、防治AD、改善睡眠等方面的主要成分和作用机制，发现与调节GABA，乙酰胆碱酯酶（AchE）、5-羟色胺（5-HT），Clu，多巴胺（DA）等神经递质水平有关。本研究中的GO功能富集和DAVID分析结果表明，EOKC与胆碱能相关神经元的突触释放及精神分裂、抑郁、酒精成瘾等疾病相关性较大。胆碱酯酶是胆碱能系统的重要组成部分，是治疗精神分裂、抑郁、酒精成瘾、AD等疾病的重要靶点［20-22］。ZHAO等［14］报道了EOKC具有抑制AchE和丙酰胆碱酯酶的活性。石竹烯还具有较强的神经保护作用［23］，其可通过苯二氮-GABA能、羟色胺能和羟基能系统发挥抗惊厥、抗焦虑和抗抑郁等神经药理作用［24］。同样以石竹烯为主成分的莪术挥发油在戊巴比妥诱导睡眠实验和焦虑实验中被证实具有5-HT1A介导抗焦虑作用［25］。本研究中的PPI结果显示，GABRA在众多靶点中拥有较高的度值，其中GABRA1与包括石竹烯在内的14种成分相关联。可通过神经活性配体-受体相互作用、逆行神经信号、酒精上瘾等通路发挥作用，在疾病分析结果中显示可能具有酒精依赖、情感障碍、自闭症、抑郁症等疾病的治疗作用。有研究表明，GABRA是配体门控的氯离子通道，介导大多数中枢神经系统的快速抑制性神经传递［26］，也是哺乳动物中枢神经系统中主要的抑制性神经递质，在介导乙醇中发挥主要作用［27］。目前EOKC的神经系统相关研究较少，网络药理学结果可为拓宽其应用范围提供思路。

图4 EOKC的成分-靶点-通路网络图Fig.4 Components-targets-pathways network

表3 GO功能富集结果Tab.3 Results of GO function enrichment

综上所述，本研究中建立的基于GC-MS法及网络药理学的成分分析方法，适合快速鉴定特定的挥发油产品，多角度、多层次对其相关成分、靶点、通路、疾病做出分析预测。直接基于实验获得药物成分，提高了数据的准确性与全面性，系统研究了EOKC主要活性成分及其药理作用机制，对侗药黑老虎开发和利用具有重要意义。为EOKC的药理学研究提供思路，有利于民族药的开发与可持续发展。

表4 相关性排名前20的疾病分析Tab.4 Top 20 related diseases