孕中期超声软指标联合无创基因检测在胎儿染色体异常诊断中的应用

杜秀凤，史淑琼，陈淑芬，宋春林，罗润环

（佛山市妇幼保健院，广东 佛山 528000）

出生缺陷是导致新生儿残疾、死亡的主要因素，我国每年约有80 ～100 万有缺陷的新生儿出生，这一直是国家和社会非常重视的公共卫生问题。产前诊断是保证优生优育的重要措施。产前超声诊断具有图像清晰、诊断准确、安全性高等优点，是产前诊断中极其重要的组成部分[1-3]。超声软指标是指胎儿超声检查时发现的一些轻微病变或变异，可在染色体正常胎儿群体中发生，也可能导致胎儿发生明显的先天性结构畸形，其与染色体异常有一定的关联，常被用于胎儿染色体非整倍体的筛查[4-7]。笔者选取286 例超声发现孤立性软指标阳性的孕妇进行研究，旨在探讨孕中期超声软指标联合无创基因检测在产前诊断中的应用价值。现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取在佛山市妇幼保健院产科门诊接受常规产检的孕妇5617 例，从中筛选出286 例孤立性超声软指标阳性孕妇，其年龄为18 ～34 岁，孕周为17+2 ～24+5 周。其纳入标准是：1）单胎妊娠；2）唐氏筛查低风险；3）超声软指标异常，具体包括：胎儿鼻骨发育不良或缺失、脉络丛囊肿、肠管回声增强、肾盂增宽、单脐动脉、心脏内强回声光点、股骨短小、右锁骨下动脉狭窄。其排除标准是：1）高龄妊娠；2）超声发现明确的胎儿先天性结构畸形；3）存在恶性肿瘤；4）近1 年内接受过异体输血、移植手术、异体细胞治疗；5）其本人和（或）其丈夫存在染色体异常。

1.2 方法

对这些产前超声筛查显示超声软指标阳性的孕妇进行无创基因检测，对其中存在无创基因高风险的孕妇再进一步进行羊膜腔穿刺产前诊断。进行产前超声筛查的方法是：采用三星WS80A 彩色多普勒超声诊断仪和GE E8 彩色多普勒超声诊断仪对孕妇的胎儿进行检查。检查前让孕妇排空膀胱，检查内容包括以下几个方面：1）颜面部：观察眼及眼眶、鼻唇；2）头部：观察颅骨结构、侧脑室、丘脑、小脑、后颅窝池、脉络从等；3）心脏：观察四腔心结构、左右房室的连接关系、心室与大动脉的连接关系；4）脊椎：观察脊柱的连续性、弯曲度、骨化程度；5）腹部：观察胃、肝、肾、膀胱等；6）四肢切面：观察四肢长骨、手足姿势等。鼻骨发育不良或缺失的判定标准是：胎儿面部正中的矢状面、冠状面和横切面均不能显示鼻骨或标准切面下鼻骨的长度小于同孕周胎儿的第2.5百分位数。脉络丛囊肿的判定标准是：超声显示脉络丛内存在薄壁囊肿。肾盂增宽的判定标准是：超声显示肾盂分离≥4mm 且＜10mm。单脐动脉的判定标准是：脐带横切面见一大一小圆形无回声结构（呈“吕”字形）。心脏内强回声光点的判定标准是：在标准四腔心平面、心室乳头肌区域出现强回声。股骨短小：股骨长度小于同孕周胎儿的第5 百分位数。右锁骨下动脉狭窄的判定标准是：弓动脉和右侧背主动脉近段异常消失，右锁骨下动脉异常狭窄。进行无创基因检测的方法是：采集孕妇的外周血10mL，提取血浆DNA。将带有序列标签的接头引物用于构建血浆DNA文库，利用illumina NextSeq CN500 测序平台进行大规模的并行基因组测序。对测序结果进行生物信息学分析，获取胎儿染色体信息，计算Z值（正常范围为＞-3且＜3），从而得出13/18/21 三体染色体非整体倍的发生风险。进行染色体核型分析的方法是：在超声引导下行羊膜腔穿刺术，抽取20 mL羊水送细胞实验室接种、培养，加秋水仙胺后收获细胞。对收获集得细胞进行低渗、固定、制片处理，用G 显带染色，在光学显微镜下分析、计数核型。进行染色体拷贝数变异检测的方法是：从羊水中提取微量(50 ～100ng)基因组DNA，采用超声法将大片段DNA 打碎，通过末端标记、接头连接和PCR 扩增等方法来进行DNA 文库的构建。使用illuminaNextSeq CN500 测序平台对样品DNA 进行大规模平行测序，对测序结果进行生物信息分析，并将其与公共数据库（OMIM、DGV、DECIPHER、UCSC 和Pubmed）进行比对。将染色体拷贝数变异分为以下三类：致病、可能致病和致病性未知。

1.3 统计学处理

研究资料的收集与分析分别采用Epi Data 3.1 软件和SPSS 21.0 软件进行，计数资料用百分比表示，采用χ²检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 286 例超声软指标阳性孕妇超声软指标的检出情况

286 例超声软指标阳性孕妇各项超声软指标检出率的高低次序（从高到低）是：脉络从囊肿＞单脐动脉＞肾盂增宽＞心脏内强回声光点＞鼻骨发育不良或缺失＞右锁骨下动脉狭窄＞肠管回声增强＞股骨短小。其脉络丛囊肿的检出率〔24.8%（71/286）〕及单脐动脉的检出率〔21.7%（62/286）〕均显著高于股骨短小的检出率〔2.8%（8/286）〕，差异具有统计学意义（P＜0.05）。详见表1。

2.2 286 例孕妇的染色体检测结果

对286 例超声软指标阳性孕妇进行无创基因检测的结果显示，其中有21 三体高风险孕妇11 例，18三体高风险孕妇2 例，13 三体高风险孕妇1 例，其他染色体高风险孕妇7 例。详见表2。21 例无创高风险孕妇经遗传咨询后均选择行羊膜腔穿刺产前诊断，检测项目包括染色体核型分析及染色体拷贝数变异 检 测（Copy number variation sequencing，CNVseq）。检测共发现18 例染色体拷贝数变异，阳性率为6.3%(18/286)， 具 体 包 括：11 例47,XN,+21、1例47,XN,+18、1 例47,XN,+13、1 例47,XXX、2 例47,XXY、1 例47,XYY、1 例22q11.21 缺失3.04Mb。

表2 不同超声软指标阳性孕妇的染色体检测结果（例）

2.3 追踪随访

进行追踪随访的结果显示，有18 例胎儿存在染色体异常。其中有21- 三体患儿11 例、18 三体患儿2 例（告知孕妇患儿有严重的智力低下、不同程度的发育畸形后其均选择引产），13 三体患儿1 例（孕19周彩超提示脉络丛囊肿，余未见明显畸形，孕妇及家属要求观察，孕23 周彩超发现小下颌、双肾实质回声增强、唇腭裂后选择引产），22q11.21 微缺失综合征患儿1 例（告知孕妇该综合征患儿常见的症状和体征包括先天性心脏病、腭裂及其他特殊面容，可能有生长发育及智力发育迟缓，学习认知异常等，随后其选择引产），47,XXY 患儿2 例（告知孕妇患儿可能会出现无精症、无生育能力等情况后，其选择引产），47,XXX 患儿1 例，47,XYY 患儿1 例。由于47,XXX患儿、47,XYY 患儿一般有生育能力，且智力尚可，孕妇均选择继续妊娠，新生儿随访暂未发现异常。

3 讨论

出生缺陷是指婴儿出生前发生的躯体结构、功能或代谢异常，不但严重影响儿童的身心健康和我国的人口素质，还会给很多家庭带来经济和心理上的双重负担及压力，影响家庭幸福和社会和谐。预防出生缺陷，最重要的就是做好孕期保健。超声检查的无创性、准确性及可重复性使其成为产前筛查及孕期保健最重要的手段之一。孕中期超声软指标主要有：脉络丛囊肿、单脐动脉、肾盂增宽、心脏内强回声光点、鼻骨发育不良或缺失、右锁骨下动脉狭窄、肠管回声增强和股骨短小等[8-9]。任何筛查技术都有其局限性,产前超声也不例外。因为超声筛查会受到羊水量、胎儿体位、多胎妊娠、孕妇肥胖、腹壁瘢痕或水肿等因素的影响，即使最好的医生使用最先进的设备也不能确保发现所有的胎儿畸形，且当前的超声检查结果也不能确保胎儿以后的发育不会改变。《产前超声检查指南（2012）》[10]中指出，临床超声医生除需对胎儿大小及卫生部规定的六大类致死性畸形进行筛查之外，还要对胎儿主要解剖结构进行系统观察，对严重先天性结构畸形进行系统筛查。郭芬芬等[11]对2922 例单一超声软指标阳性胎儿进行研究发现，鼻骨发育不良胎儿染色体的异常率为13.8%。这与本研究中鼻骨发育缺失或不良胎儿染色体的异常率〔15.6%（5/32）〕相近。提取孕妇外周血中胎儿的游离DNA，采用基于高通量测序技术的无创基因检测技术（Noninvasive prenatal genetic testing，NIPT）可检测胎儿21 三体、18 三体、13 三体综合征。该检测与传统的血清学筛查相比有着更高的准确性及更低的假阳性率[12]。史淑琼等[13]研究发现，NIPT 对13/18/21 三体及性染色体的检出率均可达100%，假阳性率分别是0.06%、0.08%、0.04%和0.30%。王亚男等[14]分析了780 例高危孕妇的NIPT-plus 结果，发现21- 三体、18- 三体和性染色体非整倍体的检出率分别为100%、100% 和60%。无创基因检测具有无创、快速、准确率高、特异性好等优点，为无创性产前诊断带来了新的希望。本研究将超声软指标与无创基因检测结合起来综合评估胎儿染色体非整倍体的发生风险，发现孤立性软指标异常的检出率为5.09 %，这与李秀兰等[15]研究中孤立性软指标异常的检出率（6.49%）相近。相关的研究表明，孕中期超声软指标联合无创基因检测在产前诊断中的应用价值较高[16-18]。

综上所述，孕中期超声软指标联合无创基因检测为产前筛查提供了新的思路与方案，既能提高孕妇筛查的参与度，降低有创性产前诊断引起的流产、感染等风险，又能增加染色体异常儿的检出率，提高孕期严重出生缺陷的发现率，从而有利于减少残疾新生儿的出生、提高出生人口素质，有利于促进家庭幸福和社会和谐发展。