以废糖蜜和煎炸废油为原料生产槐糖脂

罗成坤，胡琳慧，梁生康，李俊峰*

(1.青岛科技大学 海洋科学与生物工程学院,山东 青岛 266042;2.中国海洋大学 海洋化学理论与工程技术教育部重点实验室,山东 青岛 266100)

表面活性剂是一类能够降低表面张力和界面张力的两亲化合物,是多种工业和消费配方的活性或基本成分[1]。据预测,到2025年,全球对表面活性剂的需求将达到524亿美元[2]。槐糖脂(SLs)是一种由非致病性酵母菌利用亲水性(葡萄糖)和疏水性(植物油)碳源生产的糖脂类生物表面活性剂,是目前产量最高的生物表面活性剂[3]。由于其具有抗菌、抗肿瘤、乳化、抗病毒、无毒等性能[4],已广泛应用于农业[5]、食品[6-7]、生物医药[8-9]、化妆品[10-11]、三次采油[12]和其它领域[13]。目前,国内鲜见槐糖脂大规模工业化生产报道,主要原因之一是槐糖脂发酵所需原料成本过高,因此,必须通过降低这两种底物的成本来降低槐糖脂的价格[14]。利用价格低廉的农业副产品或工业废物为发酵原料替代价格昂贵的葡萄糖和植物油是最可行的措施。最近,关于利用各种低成本原料作为槐糖脂发酵生产底物的研究已经逐渐展开[15-17],结果显示,使用廉价原料作为发酵原料在降低槐糖脂生产成本方面具有巨大潜力[18]。

糖蜜是一种制糖行业的副产品,可作为低成本、可持续利用的亲水性碳源。2020国内年糖蜜产量为359万t[19]。糖蜜的组分比较复杂,主要含有约40%～60%(质量分数)的总糖(蔗糖,葡萄糖和果糖),还有一些悬浮胶体,含氮化合物,其余为水。富含碳素和价格相对便宜使糖蜜成为许多工业重要化学品的生产原料,如乙醇[20]、多糖[21-22]、2,3-丁二醇[23]和有机酸[24]的工业发酵生产。与价格昂贵的精制植物油和动物脂肪相比,煎炸废油是作为槐糖脂生产原料较好的疏水性碳源[25-27]。全球废油炸油产量日益增加,主要来源于家庭和工业,中国具有数百万家餐馆和食品工业,估计每年至少产生约500万t煎炸废油[28],大多数废油通常作为废料倒入下水道,不仅导致环境和生态问题,这些废油还可能通过非法商家使其重回餐桌,对人类健康造成一定的危害[29]。

以往的研究主要集中在使用一种低成本底物(亲水性或疏水性)作为替代原料生产槐糖脂[16,26,30],而利用价格低廉工农业废料同时替代亲脂性和亲水性碳源生产槐糖脂的研究鲜见报道。本研究旨在考察菌株O-13-1同时利用废糖蜜和煎炸废油作为底物发酵生产槐糖脂,通过摇瓶实验检测其槐糖脂的生产能力,并优化了其培养基组成;初步探究了槐糖脂粗产物的表面活性和CMC及温度、p H和盐度对所制备槐糖脂表面活性的影响。研究结果为以废糖蜜和煎炸废油为发酵底物工业化生产槐糖脂提供理论依据和技术支撑。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

菌株:球拟假丝酵母(Starmerella bombicola)O-13-1由本课题组分离,4℃斜面保存。正己烷、尿素,天津市瑞金特化学品有限公司;乙酸乙酯,浓硫酸,天津市广成化学试剂有限公司;酵母粉、琼脂,英国OXOID公司;糖蜜,青岛磐石糖业商贸有限公司;葡萄糖浆,山东正德食品有限公司;葡萄糖、苯酚,国药集团化学试剂有限公司;油酸,天津市巴斯夫化工有限公司;煎炸废油,购于肯德基快餐店;实验用水为学校物资科提供蒸馏水。

空气浴振荡器,HZQ-C型,哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;智能生化培养箱,SPX型,宁波东南仪器有限公司;全温振荡器,HZQ-Q型,哈尔滨市东连技术开发有限公司;自动界面张力仪,JZ-200A型,承德精密试验机有限公司。

1.2 培养基

YPD培养基:酵母粉10 g·L－1,蛋白胨20 g·L－1,葡萄糖20 g·L－1(琼脂20 g·L－1,固体培养基时加入)。

GYU培养基:葡萄糖100 g·L－1,酵母粉10 g·L－1,尿素1 g·L－1,p H 6.0。

发酵培养基:废糖蜜120 g·L－1,酵母粉8 g·L－1,尿素2 g·L－1,废油60 g·L－1,自然p H,根据实验需要调整各组分的用量,在115℃下灭菌30 min备用。

4%豆饼粉水解液及制备方法:量取0.25 g·L－1盐酸250 m L,加入32 g豆饼粉中,121℃水解30 min后,冷却至常温。用0.25 g·L－1氢氧化钠中和至p H 5.5～6.5之间,10 000 r·min－1离心5 min,收集上清液,将沉淀用蒸馏水洗涤一遍,收集上清液,定容至800 m L。根据不同用处加入不同的试剂,配成液体培养基。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株的活化

从冻箱中取出菌株O-13-1的冷冻管,移液器吸取10μL移入YPD平板,之字划线法活化,28℃倒置培养48 h左右,挑取单菌落转接YPD斜面。

1.3.2 种子液准备

用接种环从YPD斜面挑取少量菌苔,转接入装有5 m L GYU液体培养基的试管中,将试管置于28℃空气浴振荡器中150 r·min－1振荡培养24 h。

1.3.3 发酵培养

用移液器吸取1 m L培养24 h的O-13-1种子液,转接入装有50 m L发酵培养基的250 m L锥形瓶,30℃,200 r·min－1振荡培养。24 h后,观察菌体生长情况,并将油脂按实验设计分别加入到不同培养基中,发酵结束后,分别提取发酵液中的槐糖脂。

1.3.4 菌体量、残油和槐糖脂含量测定

取发酵液30 m L,5 000 r·min－1离心10 min,收集菌体烘干至恒重,称重得菌体量;依次用等体积正己烷和乙酸乙酯萃取上清液两次,40℃减压旋蒸去除有机溶剂后,放进烘箱48 h至恒重,用万分之一天平称重,分别得残油量和槐糖脂粗品量[31]。

1.3.5 各实验条件对槐糖脂产量影响的实验设计

1.3.5.1 酵母粉的有无对槐糖脂产量影响的实验

为考察酵母粉的有无对槐糖脂产量的影响,设计实验方案见表1。

表1 酵母粉的有无对槐糖脂产量影响的实验设计Table 1 Effect of yeast extract added or not on the production of sophorolipids

1.3.5.2 不同氮源对槐糖脂产量影响的实验

为考察有机氮源种类对槐糖脂产量的影响,将120 g·L－1废糖蜜,60 g·L－1煎炸废油分别加入5 g·L－1的安琪酵母粉、国产酵母(河北利华生物科技有限公司)、进口酵母(OXOID)、破碎酵母、豆饼粉水解液或玉米浆,摇瓶发酵96 h,测定槐糖脂产量。

1.3.5.3 酵母粉浓度对槐糖脂产量影响的实验

为考察酵母粉量对槐糖脂产量的影响,在120 g·L－1废糖蜜和60 g·L－1煎炸废油混合溶液中中分别添加浓度为1、2、3、4、5、6 g·L－1的酵母粉,摇瓶发酵96 h,测定槐糖脂产量。

1.3.5.4 煎炸废油量对槐糖脂产量影响的实验

为考察脂溶性碳源量对槐糖脂产量的影响,在120 g·L－1的废糖蜜和5 g·L－1的酵母粉培养基中分别加入浓度为30、60、90、120 g·L－1的煎炸废油,摇瓶发酵96 h,测定槐糖脂产量。

1.3.5.5 废糖蜜量对槐糖脂产量影响的实验

为考察废糖蜜量对槐糖脂产量的影响,在60 g·L－1煎炸废油和5 g·L－1的酵母粉培养基中分别加入浓度为60、120、180、240、300 g·L－1的废糖蜜,摇瓶发酵96 h,测定槐糖脂产量。

1.3.5.6 煎炸废油添加方式对槐糖脂产量影响的实验

为考察煎炸废油加入方式对槐糖脂产量的影响,60 g·L－1煎炸废油分别一次性加入、分2次或3次加入,摇瓶发酵96 h,测定槐糖脂产量。

1.3.6 槐糖脂粗品表面张力(γ)和临界胶束浓度浓度(CMC)测定

槐糖脂粗品表面张力和临界胶束浓度(CMC)的测定以吊片法常温下测定[32],确定CMC的具体方法:通过测定一系列不同浓度槐糖脂溶液的表面张力,随后以γ对槐糖脂浓度的对数变化作图,将曲线转折点两侧的直线部分外延,交点所对应的槐糖脂溶液浓度即为槐糖脂溶液的CMC。

1.3.7 温度、p H及盐度对槐糖脂表面活性影响的实验设计

1.3.7.1 温度对槐糖脂表面活性影响的实验

为考察温度对槐糖脂表面活性的影响,将0.2 g·L－1的槐糖脂溶液分别在10、20、30、40、50、60、70、80和90℃条件下孵育30 min,随后测定其表面张力的变化。

1.3.7.2 p H对槐糖脂表面活性影响的实验

为考察p H对槐糖脂表面活性的影响,采用1 mol·L－1的盐酸溶液或1 mol·L－1的氢氧化钠溶液,将0.2 g·L－1的槐糖脂溶液的p H值分别调整为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0,测定不同p H条件下槐糖脂溶液的表面张力。

1.3.7.3 盐度对槐糖脂表面活性影响的实验

考察盐度对槐糖脂表面活性的影响,向0.2 g·L－1的槐糖脂溶液中添加NaCl,使溶液的最终盐浓度分别达 到0%、3%、6%、9%、12%、15%、18%和21%,测定不同盐度下槐糖脂溶液的表面张力。

1.3.8 实验数据处理方法

采用origin 9.0软件进行实验数据处理,显著性检验采用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析。

2 结果与讨论

2.1 酵母粉的有无对槐糖脂产量的影响

酵母粉的有无(不同方案)对槐糖脂产量的影响见图1。

图1 酵母粉的有无对槐糖脂产量的影响Fig.1 Effect of yeast extract added or not on the production of sophorolipids

有机氮源酵母粉的添加对槐糖脂的产量有明显的促进作用,含有酵母粉的培养基,所产槐糖脂量要高很多,最高可达43.44 g·L－1,不含酵母粉的培养基,菌体几乎检测不到,同时,槐糖脂的产量也很低,最低为1.32 g·L－1。实验结果说明,酵母粉的添加对槐糖脂的生产是必需的。Van RENTERGHEM和CASAS等[33-34]也报道了类似的研究结果,可能的原因是酵母粉含有的生长因子可以促使菌体迅速生长,尽快达到对数期,从而提高了原料的利用率和底物转化率。

2.2 不同氮源对槐糖脂产量的影响

既然有机氮源对O-13-1菌株发酵生产槐糖脂是必需的,考察了几种常用氮源及超声破碎的O-13-1酵母菌体对槐糖脂产量的影响,结果见图2。

图2 有机氮源种类对槐糖脂产量的影响Fig.2 Effect of types of organic nitrogen source on the production of sophorolipids

从图2可以看出,槐糖脂产量和菌体量随氮源种类的不同而变化。从槐糖脂的产量来看:进口酵母粉的产量最大,为40.78 g·L－1,其次是安琪酵母和国产酵母粉,破碎酵母与豆饼粉的槐糖脂产量较低,玉米浆为氮源时的糖脂产量最低,仅为4.32 g·L－1。从菌体量来看:加入破碎酵母与豆饼粉培养基中的菌体量最少,安琪酵母和进口酵母适中,而加入玉米浆和国产酵母培养基中的菌体量较大,分别为13.50和13.26 g·L－1。根据实验结果选择进口酵母粉作为槐糖脂发酵生产的有机氮源。王爱云等[35]利用有机氮源(酵母粉、玉米浆、蛋白胨)和无机氮源(氯化铵、硫酸铵)分别进行发酵,结果显示酵母粉作为有机氮源时的效果最好,更有利于菌体生长和产物合成。

2.3 酵母粉浓度对槐糖脂产量的影响

酵母粉用量对槐糖脂产量的影响见图3。

图3 酵母粉用量对槐糖脂产量的影响Fig.3 Effect of concentration of yeast extract on the production of sophorolipids

图3结果显示槐糖脂的产量和菌体量都随酵母粉浓度的增加而增大,说明酵母粉对槐糖脂的生产有较强的促进作用。当酵母粉量增加到5和6 g·L－1时,槐糖脂产量分别为52.95和52.69 g·L－1,因此,选择发酵培养基中酵母粉的添加量为5 g·L－1,COOPER等[36]的研究结果与本课题结果一致,5 g·L－1酵母粉为槐糖脂生产的最佳浓度。CASAS等[34]的研究发现酵母粉为1 g·L－1时槐糖脂产量较高,为50.0 g·L－1,增加到5 g·L－1时,槐糖脂产量仅有10.0 g·L－1。VAN RENTERGHEM等[33]也发现酵母粉在1 g·L－1左右时,对槐糖脂的生产起促进作用,当酵母粉含量超过10 g·L－1时,则导致槐糖脂产量下降。可能过多的酵母粉添加,会导致菌体过多利用底物进行自身生长繁殖,从而降低槐糖脂产量[4]。

2.4 煎炸废油量对槐糖脂产量的影响

作为槐糖脂发酵生产的脂溶性碳源添加量是重要考察目标。煎炸废油量对槐糖脂产量的影响结果见图4。

图4 煎炸废油量对槐糖脂产量的影响Fig.4 Effect of the concentration of waste frying oil on the production of sophorolipids

槐糖脂的产量随煎炸废油量的增加而增加,当添加量为60、90和120 g·L－1时,相应的槐糖脂产量为47.96、48.84和61.88 g·L－1。同时观察到,所产槐糖脂的颜色随煎炸废油量的增加而不断加深,可能是煎炸废油中的杂质影响了槐糖脂的性质。由于后两组实验发酵结束后的残油量较多,为发酵的后处理带来极大困难,因此,选择60 g·L－1的煎炸废油添加量进行后续实验。MADDIKERI等[37]利用煎炸废油和葡萄糖为底物,在超声波条件下进行槐糖脂发酵,当煎炸废油为40 g·L－1时,槐糖脂产量为24.7 g·L－1。FLEURACKER[25]和SHAH等[26]分别以35 g·L－1煎炸废油和40 g·L－1餐饮废油为疏水性碳源,葡萄糖为亲水性碳源,得到槐糖脂的量分别为50.0和34.0 g·L－1。

2.5 废糖蜜量对槐糖脂产量的影响

作为槐糖脂发酵生产的水溶性碳源的添加量是另一重要考察目标。废糖蜜用量对槐糖脂产量的影响见图5。

图5 废糖蜜用量对槐糖脂产量的影响Fig.5 Effect of waste molasses on the production of sophorolipids

图5显示,随着糖蜜浓度的增大,槐糖脂的产量也随之提高,说明可溶性碳源——废糖蜜量对槐糖脂的产量有促进作用,当糖蜜添加量从120 g·L－1增加到300 g·L－1,槐糖脂产量仅从48.8 g·L－1增加到53.47 g·L－1,底物量增加1.5倍,产量仅增加9.57%,考虑到生产成本,选择120 g·L－1的废糖蜜添加量进行后续实验。SOLAIMAN等[38]采用大豆糖蜜(100 g·L－1)和油酸为双碳源发酵制备槐糖脂,最终槐糖脂产量为21 g·L－1。DAVEREY等[39]研究发现,以甘蔗糖蜜(100 g·L－1)为亲水性碳源,精炼大豆油/葵花油/橄榄油分别为疏水性碳源时,槐糖脂的产量依次为23.3、17.5和19.0 g·L－1。

2.6 煎炸废油添加方式对槐糖脂产量的影响

工业上为避免底物限制,常采用分批补料发酵的方式生产槐糖脂[3],本工作探究了煎炸废油的添加方式对槐糖脂产量的影响,结果见图6。

图6 煎炸废油添加方式对槐糖脂产量的影响Fig.6 Effect of the added ways of waste frying oil on the production of sophorolipids

由图6可知,当煎炸废油分3批加入时的效果最好,产生的槐糖脂也最多,达到51.98 g·L－1(p＜0.05),其次是一次性加入60 g·L－1的煎炸废油,分两次加入时的糖脂产量最低。MADDIKERI等[37]研究显示,同样条件下分批补料发酵槐糖脂产量为55.6 g·L－1,而分批发酵产量为24.7 g·L－1。LEE等[40]在研究鼠李糖脂发酵生产时发现采用分批补料发酵方式的糖脂最终产量为22.7 g·L－1,比分批发酵方式提高1.3倍。上述结果说明,分批补料的发酵方式能够提高发酵产物的产量。

2.7 槐糖脂粗品的表面张力和临界胶束浓度

以废糖蜜和煎炸废油为碳源发酵所产槐糖脂粗品,配制成不同浓度的槐糖脂溶液,测定其表面张力,结果见图7。

图7 槐糖脂粗品溶液浓度对表面张力γ的影响Fig.7 Effect of concentration of sophorolipid(lg C)on surface tension(γ)

其表面张力随糖脂浓度的增大而迅速降低,到36.8 m N·m－1后基本保持不变,说明此时的糖脂浓度已达到临界胶束浓度(CMC)。从图7可以求算出该糖脂的CMC为0.053 mmol·L－1,相当于36.26 mg·L－1,接近于吐温系列(Tween 20-60)非离子表面活性剂的CMC,而略高于Tween 80[41],明显低于Starmerella bombicolaATCC 22214以葡萄糖和菜籽油[15]、葡萄糖和大豆黑油[42]及蔗糖和大豆油[39]为底物发酵时所产槐糖脂的CMC值,可能取决于两方面的因素,一是由于同一菌株利用不同底物所产的槐糖脂结构和组成有所差异,二是测定CMC值时所用槐糖脂的纯度可能不同[43]。

2.8 温度、p H和NaCl浓度对槐糖脂表面活性的影响

温度对槐糖脂溶液表面张力的影响见图8。

图8 温度对槐糖脂溶液表面张力γ的影响Fig.8 Influence of temperature on the surface tension of the produced sophorolipids

图8显示,从10℃到90℃的范围,槐糖脂溶液的表面张力几乎没有发生变化,一直保持低表面张力,表明槐糖脂有很好的热稳定性。在槐糖脂温度稳定性方面,其他研究者也报道了类似的趋势[44-45]。p H对槐糖脂表面活性的影响见图9。在p H 3～14的范围内,本研究所产槐糖脂表现出较高的表面活性,其表面张力在34.5和38.5 m N·m－1之间浮动;相比较而言,另一生物表面活性剂脂质体(liposan)的表面张力仅在2.0～5.0的窄p H范围内表现出好的表面活性[46],表明所产槐糖脂有良好的酸碱稳定性。NaCl浓度对槐糖脂表面活性的影响见图10。槐糖脂溶液在NaCl浓度为0～21%范围均保持较高的表面活性,JOSHI等[47]报道了地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)R2产生物表面活性剂仅在4%～10%的盐浓度范围内能够保持较高表面活性,说明槐糖脂对高盐条件的耐受性很强。

图9 p H条件对槐糖脂溶液表面张力γ的影响Fig.9 Influence of p H on the surface tension of the produced sophorolipids

图10 NaCl浓度对槐糖脂溶液表面张力γ的影响Fig.10 Influence of salt concentration on the surface tension of the produced sophorolipids

3 结 论

利用废糖蜜和煎炸废油为双相碳源发酵制备槐糖脂时,作为生长因子和有机氮源的酵母粉是必需的,且进口酵母粉的促进作用明显;槐糖脂的产量随废糖蜜和煎炸废油量的增大而增加,最终确定发酵制备槐糖脂的培养组分:酵母粉5 g·L－1,蔗糖糖蜜120 g·L－1,煎炸废油60 g·L－1,等分3次加入,经96 h发酵的槐糖脂产量为51.78 g·L－1,比优化前增加了16.62%。所产槐糖脂生物表面活性剂具有良好的表面活性和良好的温度、盐度及p H稳定性,在20℃下能使纯水的表面张力降低至36.8 m N·m－1,临界胶束浓度(CMC)为36.26 mg·L－1;其表面活性可在较宽温度范围内(10～90℃)保持基本不变,并可在0～21%的NaCl溶液中和p H为3～14范围内保持良好的表面活性。以廉价的废糖蜜和煎炸废油为底物,发酵生产槐糖脂的原料成本比大豆油降低了22.96%,可作为槐糖脂发酵常规碳源的替代品,在槐糖脂的工业化规模生产具有重要应用价值。