迷迭香提取物对冷藏加州扁鸟蛤的抗氧化作用

刘 嘉 雯， 阴 法 文，2，3， 周 大 勇，2，3

(1.大连工业大学 食品学院， 辽宁 大连 116034； 2.大连工业大学 国家海洋食品工程技术研究中心， 辽宁 大连 116034； 3.大连工业大学 辽宁海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心， 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

双壳贝类海产品深受世界各国消费者的欢迎，其市场需求量逐年升高[1]。联合国粮农组织统计数据显示，2018年全球海洋双壳贝类总产量高达1 730万吨[2]。其中，加州扁鸟蛤(Clinocardiumcaliforniense)作为一种典型双壳经济贝类，广泛养殖于各大海域，其口味佳、营养价值高、生长速度快，已成为餐桌上的日常海鲜[3]。

由于高水分活性、高酶活和中性pH等因素的影响，贝类等海产品在捕捞后的贮运过程中极易腐烂变质，导致质量劣化和商业价值损失[4]。为保持海产品品质，低温冷藏常被应用于海产品的流通和贮藏过程中[5]。与冷冻方式相比，冷藏可以在一定时间内更好地保持海产品的感官和营养特性，且其运行成本也相对较低[6]。然而，冷藏海产品的脂质和蛋白质容易发生氧化，进一步引起风味、颜色、质感、营养等品质的降低[7]。

目前，天然抗氧化应用于冷藏水产品的研究多集中于鱼类，而应用于贝类的研究则相对较少。在众多天然抗氧化剂中，迷迭香提取物是一种常见且可应用于食品的添加剂，其具有高效的抗氧化和抑菌活性[8]。本研究以加州扁鸟蛤为研究对象，探讨了迷迭香提取物对冷藏加州扁鸟蛤的抗氧化保护作用，以期为冷藏双壳贝类的品质提升和相关质控技术的研发提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜加州扁鸟蛤，辽宁省大连市长兴市场。

迷迭香提取物，河南豫中生物科技有限公司；巯基/羰基测定试剂盒，南京建成生物科技有限公司；凝胶电泳试剂，上海碧云天生物技术有限公司；甲醇、三氯甲烷、1，1，3，3-丙二醛缩四甲醇，Sigma公司；其他试剂，天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

LG-1.0型真空冷冻干燥机，沈阳航天新阳速冻设备制造有限公司；Agilent890N气相色谱仪，美国Agilent公司；CR22N高速冷冻离心机，日本HITACHI公司；M200多功能酶标仪，瑞士TECAN公司；A200电子顺磁共振波谱仪，德国BRUKER公司；F2700荧光分光光度计，日本HITACHI公司。

1.3 方 法

1.3.1 样品的制备

1.3.1.1 预处理

将新鲜加州扁鸟蛤去壳取肉并洗净，分成三份，一份置于-30℃冰箱中存放，作为冷藏前样品，另外两份分别在0.15%迷迭香提取物溶液和去离子水中浸泡3 h(料液比1∶4、4 ℃)后沥干水分，4 ℃贮藏，在贮藏的第1、2、3天后取样。所有样品均分成两部分处理，一部分于置于-30 ℃冰箱中存放备用，另外一部分真空冷冻干燥后，粉碎制粉，用于提取油脂检测。

1.3.1.2 油脂提取

以冻干鸟蛤肉粉为原料，采用Folch法[9]提取总脂。

1.3.1.3 肌原纤维蛋白提取

以鸟蛤肉样为原料，采用Liu[10]的方法提取肌原纤维蛋白。将5 g鸟蛤肉加入20 mL 10 mmol/L、pH 7.0磷酸钠缓冲液中，在冰浴条件下，以12 000 r/min均质1 min；混合物在4 ℃下5 000 r/min离心10 min，保留沉淀。重复离心3次。用0.1 mol/L NaCl缓冲液洗涤，4 ℃ 5 000g离心10 min。重复洗涤3次，所获沉淀物即为肌原纤维蛋白。

1.3.2 硫代巴比妥酸值的测定

参照Khan等[11]的方法进行硫代巴比妥酸的测定，稍做修改。取肉样0.25 g(以0.25 mL去离子水为对照)，加入1 mL 10%三氯乙酸和1 mL 去离子水，室温下8 000g离心5 min。取上清液1 mL加入0.01 mol/L硫代巴比妥酸1 mL，沸水浴25 min，冷却后测定532 nm处吸光度。根据1，1，3，3-丙二醛缩四甲醇标准曲线计算结果[12]。

1.3.3 巯基的测定

采用蛋白质巯基分析试剂盒测定肉样的巯基含量，结果以mmol/g蛋白质表示[13]。

1.3.4 羰基的测定

采用蛋白质羰基测定试剂盒测定肉样羰基含量，结果以nmol/mg蛋白质表示[14]。

1.3.5 酸值的测定

参照国家标准GB 5009.229—2016测定油脂样品酸值。

1.3.6 席夫碱类物质的测定

参照Gatellier等[15]的方法测定肉样席夫碱类物质。称取肉样4.0 g，加入10 mL 20 mmol/L、pH 6.5磷酸盐缓冲液进行匀浆，8 000g常温离心5 min。取上清，分光光度计于320～480 nm下扫描荧光发射光谱(激发波长360 nm，激发发射狭缝5 nm)，结果以荧光强度表示。

1.3.7 表面疏水性的测定

参照Ma等[16]的方法测定肌原纤维蛋白的表面疏水性。肌原纤维蛋白溶于0.6 mmol/L NaCl中，用10 mmol/L、pH 7.0磷酸钠缓冲液稀释至0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL。将2 mL稀释样品与25 μL 8 mmol/L的1-苯胺基-8-萘磺酸盐(ANS)溶液混合。使用荧光分光光度计在390 nm(激发)和470 nm(发射)波长下测定相对荧光强度。表面疏水性表示为相对荧光强度与蛋白质浓度的初始斜率[17]。

1.3.8 脂肪酸组成分析

参照国家标准GB 5009.168—2016分析脂肪酸组成。

1.3.9 统计学方法

所有指标的检测均重复进行3次，实验结果以(平均值±标准差)表示。采用Spss19.0软件进行统计分析，采用ANOVA分析和Tukey’s检验进行统计学分析。不同英文字母表示存在显著性差异(P<0.05)。

2 结果与讨论

2.1 巯基质量摩尔浓度

添加迷迭香提取物对冷藏过程中加州扁鸟蛤巯基质量摩尔浓度变化的影响如图1所示。由图1可以看出，随着贮藏时间的延长，两组样品的巯基质量摩尔浓度均呈现下降趋势。贮藏3 d后，对照组和处理组样品的巯基质量摩尔浓度分别为(1.12±0.02) mmol/g和(1.28±0.07) mmol/g，分别降低45.37%和37.56%。Lu等[6]研究发现，在4 ℃贮藏过程中，鳙鱼片的巯基质量摩尔浓度逐渐下降，与本研究结果相似。此外，贮藏相同时间，迷迭香提取物处理组样品的巯基质量摩尔浓度显著高于对照组(P<0.05)，说明迷迭香提取物有效抑制了鸟蛤蛋白质中巯基的氧化。

图1 迷迭香提取物对冷藏过程中加州扁鸟蛤 巯基质量摩尔浓度变化的影响

2.2 羰基质量摩尔浓度

添加迷迭香提取物对冷藏过程中加州扁鸟蛤羰基质量摩尔浓度变化的影响。如图2所示。由图2可见，随着贮藏时间的延长，两组样品的羰基质量摩尔浓度变化量均呈现上升趋势。贮藏3 d后，对照组和处理组样品的羰基质量摩尔浓度分别增加(4.79±0.34) nmol/mg和(3.42±0.86) nmol/mg，分别提高3.84倍和2.45倍。Lu等[6]发现鳙鱼片在4 ℃贮藏过程中，羰基含量上升，与本研究的规律相似。此外，贮藏相同时间，迷迭香提取物处理组样品的羰基含量显著低于对照组，说明迷迭香提取物对鸟蛤中特定氨基酸氧化侧链的金属催化氧化反应起到了抑制作用。

图2 迷迭香提取物对冷藏过程中加州扁鸟蛤 羰基质量摩尔浓度变化的影响

2.3 表面疏水性

添加迷迭香提取物对冷藏过程中加州扁鸟蛤表面疏水性变化的影响如图3所示。由图3可以看出，随着贮藏时间的延长，两组样品的表面疏水性均呈现上升趋势。贮藏3 d后对照组和处理组样品的表面疏水性分别为(2 148.9±22.52)和(1 395.33±19.41)，分别提高2.31倍和1.15倍。Roura等[18]发现新鲜鳕鱼在冰上贮藏后表面疏水性呈现上升趋势，与本研究规律相似。贮藏相同时间，处理组样品的表面疏水性低于对照组，说明迷迭香提取物对鸟蛤中的蛋白质氧化导致的疏水基团暴露有抑制作用。

图3 添加迷迭香提取物对冷藏过程中加州扁 鸟蛤表面疏水性变化的影响

2.4 硫代巴比妥酸值

添加迷迭香提取物对冷藏过程中加州扁鸟蛤硫代巴比妥酸值变化的影响如图4所示。由图4可见，随着贮藏时间的延长，两组样品的硫代巴比妥酸值均呈上升趋势。贮藏3 d后，对照组和处理组样品的硫代巴比妥酸值分别为(6.01±0.18) mg/g和(4.09±0.30) mg/g，分别提高了4.18倍和2.53倍。Zhou等[19]研究发现，在4 ℃贮藏过程中，贻贝肉的硫代巴比妥酸值逐渐上升，与本研究结果相似。此外，贮藏相同时间，处理组样品的硫代巴比妥酸值显著低于对照组，说明迷迭香提取物有效抑制了鸟蛤中脂质次级氧化产物丙二醛的生成。

图4 迷迭香提取物对冷藏过程中加州扁鸟蛤 硫代巴比妥酸值变化的影响

2.5 酸 值

添加迷迭香提取物对冷藏过程中加州扁鸟蛤酸值变化的影响如图5所示。由图5可看出，随着贮藏时间的延长，两组样品的酸值均呈现上升趋势。贮藏3 d后，对照组和处理组样品的酸值分别为(44.98±1.50) mg/g和(44.88±0.30) mg/g，分别增大了0.50倍和0.49倍。王建辉等[20]发现草鱼肌肉脂质在4 ℃贮藏过程中，酸值上升，与本研究的规律相似。此外，贮藏相同时间，迷迭香提取物处理组样品的酸值略低于对照组，但差异不显著，说明了迷迭香提取物不能有效抑制脂质水解产物游离脂肪酸的生成。

图5 添加迷迭香提取物对冷藏过程中加州扁 鸟蛤酸值变化的影响

2.6 脂肪酸组成分析

添加迷迭香提取物对冷藏过程中加州扁鸟蛤脂肪酸组成变化的影响如表1所示。在新鲜鸟蛤肉中检测到多种脂肪酸，其中，二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)含量最丰富。新鲜鸟蛤肉中多不饱和脂肪酸(PUFA)质量分数占总脂肪酸的(65.94±2.11)%。冷藏过程中，对照组和处理组样品的PUFA，尤其是EPA和DHA的相对质量分数均略有下降，而饱和脂肪酸(SFA)的质量分数则略有上升。

刘冬敏等[21]研究发现在冷藏过程中，草鱼肌肉的总脂肪质量分数逐渐降低，单不饱和脂肪酸(MUFA)和PUFA的相对质量分数逐渐降低，SFA的相对含量逐渐升高。贮藏相同时间，迷迭香提取物处理组样品的PUFA质量分数略高于对照组，但结果并无显著性差异。

表1 添加迷迭香提取物对冷藏过程中加州扁鸟蛤脂肪酸组成变化的影响Tab.1 Effect of adding rosemary extract on the fatty acid compositions of the lipids recovered fromClinocardium californiense meat under refrigerated storage %

2.7 席夫碱类物质

添加迷迭香提取物对冷藏过程中加州扁鸟蛤席夫碱类物质变化的影响如图6所示。由图6可以看出，随着贮藏时间的延长，对照组和处理组样品的荧光强度均呈上升趋势。贮藏时间相同时，处理组样品的荧光强度低于对照组，进而说明了迷迭香提取物对鸟蛤中脂质和蛋白氧化的相互作用有抑制作用。

图6 迷迭香提取物对冷藏过程中加州扁鸟蛤 席夫碱类物质变化的影响

3 结 论

在冷藏过程中，加州扁鸟蛤的脂质和蛋白质均发生水解和氧化，且对照组和迷迭香提取物处理组的各项指标均呈现相同变化规律：硫代巴比妥酸值、羰基质量摩尔浓度、酸值、席夫碱类物质、疏水性均逐渐上升，巯基质量摩尔浓度和多不饱和脂肪酸质量分数均逐渐降低。与对照组相比，迷迭香提取物处理组的各项指标均较佳，说明迷迭香提取物可有效抑制加州扁鸟蛤在冷藏过程中的脂质和蛋白质的水解和氧化。