刺玫果籽中原花青素与多糖的提取及其体外活性

崔 遥， 钟 方 丽， 王 晓 林， 王 朝 勃

(吉林化工学院 化学与制药工程学院， 吉林 吉林 132022 )

0 引 言

刺玫果是蔷薇科属植物山刺玫的成熟果实[1]，含有丰富的三萜类、黄酮类、鞣质、维生素等活性成分[2]。原花青素是一大类多酚类化合物的总称，由于其能够在热酸性条件下产生花青素而被命名为原花青素[3]，抗氧化能力是维生素C的20倍、维生素E的50倍[4]，抗氧化活性物质能减少或清除自由基的氧化反应，能防治疾病、延缓衰老[5]。多糖是以醛糖或酮糖通过糖苷键链接而成的高分子化合物，又称多聚糖[6]。刺玫果多糖能够激活免疫系统，在抗疲劳[7]、抗衰老、降血脂、降血糖[8]、抗氧化、抗肿瘤[9]等方面发挥重要作用。与合成药物相比，中草药副作用小、安全，近年来对中草药抗氧化成分的提取愈加重视[10-11]。

目前，国内外对刺玫果的研究多数针对完整的果实，很少将刺玫果籽和果肉分开进行研究[12]。刺玫果籽作为刺玫果加工副产物，富含大量的原花青素及刺玫果籽油，具有较高的开发价值[13]。原花青素的提取方法包括直接浸提法、有机溶剂提取法、超声波辅助法、酶提取法以及微波辅助法[14]等。刺玫果多糖的提取方法主要有水提法、超声波辅助法、微波辅助法[15]等。超声波辅助法能提高提取效率，缺点是高温会使热敏物质分解[16]、超声时间处理不当也会使多糖结构被破坏。本研究利用柱层析法[17]进行提取，该方法与原花青素的直接浸提法、多糖的水提法类似，均利用溶剂进行提取，在上柱前将原料与提取溶剂混合后进行超声，该部分应用了超声波辅助法，柱层析法用一种溶剂提取原料后，更换大极性溶剂提取另一类成分。柱层析法可同时提取两类及以上成分，避免孤立地提取其中一类成分而造成原料和提取溶剂的浪费，而且工艺简单，操作简便[18]。本研究确定提取的最佳工艺参数，利用柱层析法同时提取原花青素与多糖，采用醇沉法将二者分离，并考察了刺玫果籽原花青素与多糖提取物清除羟基自由基和抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料：刺玫果，安徽亳州医药总公司；原花青素对照品，成都曼思特生物科技有限公司；葡萄糖对照品，天津市瑞金特化学品有限公司；α-葡萄糖苷酶，上海宝曼生物科技有限公司；4-硝基苯α-D-吡喃半乳糖苷(PNPG)，北京梦怡美生物科技有限公司；阿卡波糖，西安拓丰生物科技有限公司；无水甲醇，天津市瑞金特化学品有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

主要仪器：TU-1950型紫外-可见分光光度仪，北京普析通用仪器有限责任公司；PL-9602型酶标仪，北京普朗新技术有限公司；RE-52C型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；CHA-S型数显恒温振荡器，金坛市华城开元试验仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 原料预处理

取刺玫果于60 ℃干燥至恒重后剥离刺玫果籽，粉碎，过80目筛得刺玫果籽粉末。

1.2.2 原花青素及多糖质量分数的测定方法

1.2.2.1 原花青素质量分数的测定

采用硫酸铁铵-浓盐酸法[19]。取适量原花青素对照品，无水甲醇溶解，吸取不同浓度梯度对照品溶液1 mL于10 mL容量瓶中，加入反应混合液9 mL，沸水浴加热40 min，冰水浴冷却15 min，正丁醇定容。以不加原花青素对照品的平行样为空白，于550 nm处测定吸光度，绘制原花青素标准曲线(y=0.018 9x+0.006 3，R2=0.999 4)。

吸取供试品溶液1 mL于10 mL容量瓶中，按照硫酸铁铵-浓盐酸法，以不加供试品溶液的平行样为空白，测定550 nm处吸光度，根据标准曲线计算供试品溶液中原花青素的质量分数。

w(原花青素)=ρ1V1f1/1 000m1

式中：w(原花青素)为供试品溶液中原花青素质量分数，mg/g；ρ1为刺玫果籽提取液中原花青素质量浓度，μg/mL；V1为原花青素提取液体积，mL；f1为稀释倍数；m1为刺玫果籽粉末质量，g。

1.2.2.2 多糖质量分数的测定

采用苯酚-浓硫酸法[20]。取葡萄糖对照品适量，用蒸馏水配制成不同浓度梯度的对照品溶液。取对照品溶液2.0 mL 于10 mL容量瓶中，加入4%苯酚溶液1.0 mL，浓硫酸7.0 mL，静置至室温，40 ℃水浴加热30 min，冷却至室温。以不加葡萄糖对照品的平行样为空白，于490 nm处测定吸光度，绘制葡萄糖标准曲线(y=0.053 6x-0.043 3，R2=0.999 5)。

吸取供试品溶液2 mL于10 mL容量瓶中，按照苯酚-浓硫酸法，以不加供试品溶液的平行样为空白，于490 nm处测定吸光度，再根据标准曲线计算供试品溶液中多糖的质量分数。

w(多糖)=ρ2V2f2/1 000m2

式中：w(多糖)，为供试品溶液中多糖质量分数，mg/g；ρ2为刺玫果籽提取液中多糖的质量浓度，同μg/mL；V2为多糖提取液的体积，mL；f2为稀释倍数；m2为刺玫果籽粉末的质量，g。

1.2.3 样品上柱前处理工艺参数的确定

1.2.3.1 溶剂体积分数的确定

称取12份刺玫果籽粉末，每份1.0 g，分别加入体积分数为0、20%、40%、60%、80%、100%乙醇水溶液10 mL，室温摇床振荡(200 r/min)1 h，6 000 r/min离心10 min，分别按照原花青素及多糖的质量分数测定方法进行测定，计算原花青素、多糖的质量分数。确定刺玫果籽原花青素、多糖的溶剂体积分数。

1.2.3.2 吸涨率和浸泡平衡时间的确定

称取12份刺玫果籽粉末，每份1.0 g，分别加入相应配比的提取溶剂10 mL，室温摇床振荡(200 r/min)，浸泡时间分别为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h，6 000 r/min离心10 min，分别测定上清液体积，总体积(10 mL)减去上清液体积，差值即刺玫果籽原花青素与多糖的吸涨率。

在吸涨率的确定试验中，当上清液中对应的原花青素与多糖的质量分数基本不变时所对应的时间即为浸泡平衡时间，确定原花青素与多糖的浸泡平衡时间。

1.2.3.3 超声辅助时间的确定

称取刺玫果籽粉末10份，每份1.0 g，分别加入相应配比的提取溶剂10 mL，室温超声辅助5、10、15、20、25 min后摇床振荡(200 r/min)至浸泡平衡时间，6 000 r/min离心10 min，分别按照原花青素与多糖的质量分数测定方法进行测定，确定刺玫果籽原花青素与多糖的超声辅助时间。

1.2.4 柱层析法分别提取及联合提取原花青素与多糖

选取直径为1.5 cm的玻璃层析柱，精密称取刺玫果籽粉末5.0 g，加入原花青素的提取溶剂，即60%乙醇水溶液湿样上柱，保持60%乙醇水溶液没过样品，室温静置至浸泡平衡时间，以1吸涨率为1个收集单位，以0.4 mL/min收集，共收集3份洗脱液，残渣(60%乙醇水溶液洗脱3次后的刺玫果籽粉末)加入1吸涨率的60%乙醇水溶液，经超声提取1 h，抽滤再得到1份残渣提取液，分别测定3份洗脱液和1份残渣提取液中原花青素的质量。同样方法，用纯水上样，收集3份洗脱液和1份残渣(用纯水洗脱3次后的刺玫果籽粉末)提取液，分别测定3份洗脱液和1份残渣提取液中多糖的质量。以收集的3份洗脱液和1份残渣提取液中原花青素、多糖的质量作为100%，计算刺玫果籽中原花青素、多糖的总质量，确定提取次数。

原花青素与多糖的提取连续进行，首先提取刺玫果籽原花青素，方法与分别提取刺玫果籽原花青素相同，选取直径为1.5 cm的玻璃层析柱，精密称取刺玫果籽粉末5.0 g，60%乙醇水溶液湿样上柱，保持60%乙醇水溶液没过样品，室温静置至浸泡平衡时间，以1吸涨率为1个收集单位，以0.4 mL/min的体积流量进行收集，收集3份后，洗脱液更换为多糖的提取溶剂即纯水，再收集3份洗脱液。计算刺玫果籽中原花青素、多糖的质量及提取率。

提取率=mx/m0×100%

式中：mx为柱层析同时提取时原花青素、多糖洗脱液中所含相应目标成分的质量，mg；m0为分别提取时原花青素、多糖洗脱液中所含相应目标成分的总质量，mg。

1.2.5 刺玫果籽提取液中原花青素与多糖的分离及相应成分的质量分数测定

合并柱层析同时提取得到的原花青素与多糖提取液，减压浓缩至20 mL，加80 mL无水乙醇至醇体积分数达80%，充分摇匀，冰箱4 ℃静置过夜，6 000 r/min离心10 min，上清液为原花青素提取液，沉淀为粗多糖。将上清液与沉淀均制成干浸膏(将原花青素提取液和粗多糖沉淀干燥至恒重，呈粉末状态)，测定干浸膏中原花青素与多糖的质量分数。

刺玫果籽原花青素提取物中不仅含有原花青素，还可能含有黄酮类、皂苷类等活性成分，因此对刺玫果籽原花青素提取物中总黄酮、总皂苷的质量分数也进行测定。取原花青素干浸膏，利用硝酸铝络合法[21]和香草醛-浓硫酸法[22]测定原花青素干浸膏中总黄酮和总皂苷质量分数。

1.2.6 清除羟基自由基

将柱层析提取得到的原花青素与多糖干浸膏加入相应配比的提取溶剂，溶解成不同浓度梯度的溶液即供试品溶液。

取1.5 mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液1 mL 于10 mL比色管中，依次加入PBS缓冲液2 mL、蒸馏水1 mL和0.75 mmol/L硫酸亚铁溶液1 mL，充分混合，加0.1% H2O21 mL，于37 ℃ 恒温反应60 min，536 nm处测得吸光度Ap。将1 mL 0.1%的H2O2溶液替换为1 mL蒸馏水，同法测得Ab。将1 mL蒸馏水替换为1 mL质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL的原花青素供试品溶液或质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0 mg/mL的多糖供试品溶液，同法操作测得As。计算不同样品对羟基自由基的清除率。将维生素C对照品配制成质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0、1.25、1.5、1.6、1.7、2.0 mg/mL的供试品溶液，计算其对羟基自由基的清除率[23-24]。以质量浓度为横坐标，供试品溶液对羟基自由基的清除率为纵坐标，绘制标准曲线，计算IC50。

式中：As为样品组吸光度；Ap为对照组吸光度；Ab为本底组吸光度。

1.2.7 抑制α-葡萄糖苷酶活性

向96孔板依次加入80 μL的PBS缓冲溶液和20 μL 2.5 mmol/L的PNPG底物溶液，最后加入20 μL质量浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10 mg/mL的刺玫果籽原花青素供试品溶液或质量浓度为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL的多糖供试品溶液，酶标板放置在37 ℃水浴锅中加热10 min，加入20 μL α-葡萄糖苷酶溶液，37 ℃水浴加热1 h，100 μL 0.2 mol/L的Na2CO3终止溶液终止反应，室温放置15 min，用酶标仪于405 nm 处测得吸光度Ay。用20 μL PBS缓冲液代替20 μL 供试品溶液，测得Ak。用20 μL PBS缓冲溶液代替20 μL α-葡萄糖苷酶溶液[25]，测得Ab。将阿卡波糖配制成质量浓度为1.010、3.006、5.010、7.014、10.020、20.050 mg/mL的供试品溶液，以质量浓度为横坐标，供试品溶液和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率为纵坐标绘制标准曲线，计算IC50。

式中：Ak为对照组吸光度；Ay为样品组吸光度；Ab为本底组吸光度。

2 结果与讨论

2.1 样品上柱前处理工艺参数

2.1.1 溶剂体积分数

原花青素易溶于乙醇溶液，多糖易溶于水。如图1所示，当溶剂体积分数为60%乙醇水溶液时，提取液中原花青素质量分数达到最大值16.17 mg/g；溶剂体积分数为纯水时，提取液中多糖的质量分数达到最大值62.02 mg/g，故柱层析提取时，原花青素提取溶剂选用体积分数为60%的乙醇水溶液，多糖提取溶剂选用纯水。

图1 乙醇体积分数对提取液中原花青素和 多糖质量分数的影响

2.1.2 吸涨率和浸泡平衡时间

由图2可知，刺玫果籽粉末对60%乙醇水溶液和纯水的吸收量不相同。原花青素的吸涨率为2.4 mL/g，多糖的吸涨率为2.2 mL/g，提取原花青素按照刺玫果籽粉末质量的2.4倍收集洗脱液，提取多糖按照刺玫果籽粉末质量的2.2倍收集洗脱液。

图2 浸泡时间对提取液中原花青素和多糖 吸涨率的影响

由图3可知，随着浸泡时间的延长，提取液中原花青素与多糖的质量分数逐渐升高，当浸泡时间达到2 h后，提取液中原花青素的质量分数基本不再发生变化。当浸泡时间达到3 h后，提取液中多糖的质量分数基本不再发生变化。因此原花青素在层析柱中的浸泡平衡时间为2 h，多糖在层析柱中的浸泡平衡时间为3 h，在柱层析同时提取时选择二者中时间较长者作为浸泡平衡时间，即3 h。

图3 浸泡时间对提取液中原花青素和多糖 质量分数的影响

2.1.3 超声辅助时间

由图4可知，超声辅助时间为20 min时，提取液中原花青素质量分数达到最大值19.63 mg/g；当超声辅助时间为10 min时，提取液中多糖质量分数达到最大值93.57 mg/g。因此在柱层析提取原花青素时超声辅助时间为20 min，柱层析提取多糖时超声辅助时间为10 min。利用超声波辅助法在适当时间内可提高提取液中原花青素与多糖的质量分数，这可能是由于超声波产生的机械作用和空化效应破碎了植物细胞壁，有效成分呈游离状态溶入提取溶剂中[26]。超声处理时间过长，会造成原花青素与多糖结构发生破坏。

图4 超声辅助时间对提取液中原花青素和多 糖质量分数的影响

2.2 刺玫果籽中原花青素与多糖的柱层析法提取

根据表1数据计算可知，分别提取时，残渣提取液中原花青素为4.70 mg，原花青素总质量为97.16 mg，前3份提取液中原花青素总提取率为95.16%；残渣提取液中多糖为20.85 mg，多糖总质量为458.64 mg，前3份提取液中多糖总提取率为95.46%。因此原花青素、多糖均需要收集3份洗脱液。联合提取时，3份洗脱液中原花青素和多糖提取率分别为95.08%和94.27%。柱层析法同时提取刺玫果籽中原花青素和多糖与单独提取的提取率差别不大，证明同时提取两种物质与单独提取一种物质的效率几乎相同，柱层析法具有提取效率高、节约溶剂等优势。

表1 提取液中原花青素、多糖的质量和提取率Tab.1 Mass and extraction rate of proanthocyanidins and polysaccharides in extract liquor

2.3 刺玫果籽中原花青素、多糖分离及干浸膏中成分的质量分数

合并柱层析同时提取得到的原花青素和多糖提取液，经过浓缩、醇沉、干燥，得到原花青素和多糖干浸膏，分别测定刺玫果籽原花青素干浸膏中原花青素、总黄酮、总皂苷的质量分数，测定刺玫果籽多糖干浸膏中多糖的质量分数。结果表明，刺玫果籽原花青素干浸膏中原花青素、总黄酮、总皂苷质量分数分别为145.3、399.4、32.7 mg/g，刺玫果籽多糖干浸膏中多糖质量分数为361.3 mg/g。

2.4 原花青素、多糖提取物对羟基自由基的清除作用

如图5所示，刺玫果籽原花青素、多糖提取物清除羟基自由基的能力与浓度呈正相关趋势，即提取物浓度增大，清除率也随之增大。刺玫果籽原花青素提取物质量浓度在0.1～0.7 mg/mL线性关系良好，y=122.64x-4.985 7，R2=0.900 4，IC50=0.448 4 mg/mL；刺玫果籽多糖提取物质量浓度在0.1～1.0 mg/mL线性关系良好，y=77.152x+3.228 9，R2=0.922 2，IC50=0.606 2 mg/mL。维生素C对照品的质量浓度在0.1～2.0 mg/mL线性关系良好，y=40.411x-7.186 9，R2=0.974 3，IC50=1.415 1 mg/mL。根据IC50可知，原花青素和多糖提取物均具有清除羟基自由基的能力，均强于维生素C。

图5 提取物对羟基自由基的清除能力Fig.5 Scavenging ability of proanthocyanidin extracts to hydroxyl radical

2.5 原花青素、多糖提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

对部分质量浓度与自由基抑制部分作线性关系曲线，计算不同质量浓度原花青素或多糖提取物的抑制率，得到剂量响应曲线，计算IC50。IC50越小说明其相应的体外活性越强。如图6～8所示，刺玫果籽原花青素、多糖提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力与浓度呈正相关趋势，即提取物浓度增大，抑制率也随之增大。刺玫果籽原花青素提取物质量浓度在0.01～0.10 mg/mL线性关系良好，y=644.75x+18.083，R2=0.964 4，IC50=0.050 0 mg/mL。刺玫果籽多糖提取物质量浓度在0.05～0.70 mg/mL线性关系良好，y=34.873x+37.142，R2=0.990 2，IC50=0.369 0 mg/mL。阿卡波糖对照品的质量浓度在1.01～20.05 mg/mL线性关系良好，y=2.316 7x+26.831，R2=0.946 6，IC50=10.000 0 mg/mL。原花青素与多糖提取物的IC50均小于阿卡波糖，说明原花青素与多糖提取物均具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力，且均强于阿卡波糖。

图6 原花青素提取物对α-葡萄糖苷酶活性 的抑制作用Fig.6 Inhibition to α-glucosidase activity by proanthocyanidins extracts

图7 多糖提取物对α-葡萄糖苷酶活性的 抑制作用Fig.7 Inhibition to α-glucosidase activity by polysaccharides extracts

图8 阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Fig.8 Inhibition to α-glucosidase activity by acarbose

3 结 论

通过柱层析法提取刺玫果籽中的原花青素与多糖，分别采用料液比为1∶2.4的60%乙醇水溶液作为原花青素的提取溶剂并超声20 min，料液比为1∶2.2的纯水作为多糖的提取溶剂并超声10 min，同时提取时在层析柱内浸泡3 h。结果表明，柱层析法同时提取刺玫果籽中原花青素与多糖的提取率均接近95%，提取液经醇沉法进一步分离，得到刺玫果籽原花青素提取液及多糖沉淀，刺玫果籽原花青素干浸膏中原花青素、总黄酮、总皂苷的质量分数分别为145.3、399.4、32.7 mg/g，刺玫果籽多糖干浸膏中多糖的质量分数为361.3 mg/g。体外活性试验结果表明，刺玫果籽中原花青素与多糖提取物均具有良好的清除羟基自由基的能力和抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力。常规提取方法每次只能提取一种物质，且提取温度高、提取次数多、溶剂消耗多，而柱层析法可以同时提取2～3种物质，在提取原花青素的同时可以提取多糖，常温即可进行、工艺简单、节约提取溶剂，是天然产物活性成分提取的有效方法。