超声辅助提取-反相高效液相色谱法测定虾中三磷酸腺苷及其关联产物的含量

周漪波,王和平,胡雪玉,邓远强,阮奇珺,张 飞

(广东省科学院测试分析研究所(中国广州分析测试中心),广东省化学测量与应急检测技术重点实验室,广东省保健食品功效成分检测与风险物质快速筛查工程技术研究中心,广州 510070)

虾是常见的水产品,其肉质细嫩、味道鲜美,富含蛋白质、维生素和矿物质等[1-2]。虾死后,虾肉会发生一系列生化反应,最终影响虾的品质[3-4]。鲜度是衡量虾肉品质的重要指标之一,直接决定了产品的食用价值和经济价值[5]。一般采用电子鼻、色差仪和质构仪分析虾的气味、色泽和质构等,从而对虾的鲜度进行评价。然而,这些方法对仪器要求较高,检测结果易受样品影响,且不适合大批量样品的检测。在多种酶的催化下,鱼肉中的三磷酸腺苷(ATP)依次降解为二磷酸腺苷(ADP)、腺苷酸(AMP)、肌苷酸(IMP)、肌苷(Hx R)和次黄嘌呤(Hx)[6]。文献[7]将Hx R、Hx的总和与ATP及其关联产物的总和的百分比定义为K值。而且已有学者将K值用于虾鲜度的评估[8-9]。

ATP及其关联产物的检测方法主要有高效液相色谱法[9]、滤纸电泳分析法[10]和可视化嗅觉技术-高效液相色谱法[11]等,相关标准方法为SC/T 3048-2014《鱼类新鲜度指标K值的测定 高效液相色谱法》。但该标准方法存在以下问题:①可能存在基质效应,造成干扰;②流动相为磷酸盐缓冲溶液,不含有机溶剂,容易造成部分杂质残留在色谱柱内;③色谱分离时间较长,容易造成缓冲溶液盐析。鉴于此,本工作提出了超声辅助提取-反相高效液相色谱法快速测定虾中ATP及其关联产物含量的方法,采用该方法考察了贮藏条件对K值的影响,为虾的保鲜技术和其他水产品的K值测定提供数据支持和技术借鉴。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260型高效液相色谱仪,配紫外检测器;BT125D型电子天平;T18 digital ULTRATURRAX®型均质机;FB15067型超声波清洗器;Eutech PH700型台式pH计;MILLI-Q超纯水系统。

ATP、ADP、IMP单标准储备溶液:分别称取一定量的ATP、ADP、IMP标准品,用水溶解,配制成质量浓度为1.000 g·L-1的单标准储备溶液,于4℃冰箱中保存,保存期不超过7 d。

AMP、Hx R、Hx单标准储备溶液:分别称取一定量的AMP、Hx R、Hx标准品,用水溶解并定容至10 mL(其中AMP和Hx先加5 mL水,再加2滴盐酸助溶,最后用水定容),配制成质量浓度为5.000×10-1g·L-1的单标准储备溶液,于4℃冰箱中保存,保存期不超过7 d。

混合标准溶液系列:移取适量的单标准储备溶液,用水逐级稀释,配制成ATP、ADP、IMP质量浓度 为1.250×10-1,2.500,5.000,2.500×10,5.000×10,1.000×102mg·L-1,AMP、Hx R、Hx质量浓度为6.250×10-2,1.250,2.500,1.250×10,2.500×10,5.000×10 mg·L-1的混合标准溶液系列,现配现用。

ATP、ADP、AMP、IMP、Hx R、Hx标准品的质量分数均不小于97%;甲醇为色谱纯;磷酸二氢钾、氢氧化钠、高氯酸、盐酸均为分析纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

Ultimate®XB-C4反相色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);柱温30℃;流动相A为0.048 mol·L-1磷酸二氢钾溶液(pH 5.7),流动相B为甲醇;流量1.0 mL·min-1;进样量20μL;检测波长254 nm。梯度洗脱程序:0～4.0 min时,B为0;4.0～7.0 min时,B由0升 至16.2%,保 持1.0 min;8.0～8.1 min时,B由16.2%跳转至0,保持4.9 min。

1.3 试验方法

虾样品购于超市,充氧后迅速送至实验室,去头、去壳、去虾线后,用水清洗,沥干表面水分,用粉碎机粉碎均匀后立即进行试验。

称取2.0 g(精确至0.001 g)粉碎后的虾肉于50 mL具塞离心管中,加入10%(体积分数,下同)高氯酸溶液20 mL,在冰水浴中以10 000 r·min-1转速均质1 min,超声提取5 min,于4℃以8 000 r·min-1转速离心2 min,取上清液。移取5%(体积分数,下同)高氯酸溶液20 mL,清洗均质机刀头后转移至残渣中,重复上述操作,合并两次上清液,用水定容至50 mL。分取5 mL于比色管中,用5.0 mol·L-1和2.5 mol·L-1氢氧化钠溶液调节溶液酸度至pH 6.0～6.4,再用0.048 mol·L-1磷酸二氢钾溶液(pH 5.7)定容至10 mL,按照仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按照仪器工作条件测定混合标准溶液(ATP、ADP、IMP的质量浓度为50.00 mg·L-1,AMP、Hx R、Hx的质量浓度为25.00 mg·L-1)和基围虾样品溶液,所得色谱图见图1。

图1 色谱图Fig.1 Chromatograms

由图1可见:11 min内即可实现6种目标物的快速分离,而且峰形良好,分离度较高。

2.2 色谱条件的选择

2.2.1 色谱柱

ATP及其关联产物均为极性化合物,而且结构相似,因此需要选择合适的反相色谱柱才能实现目标物的快速分离[12]。反相色谱柱固定相的碳链越长,疏水性越强,目标物的保留时间越长。为了缩短分析时间,本工作选择Ultimate®XB-C4、Venusil ASB-C8、Ultimate®XB-C18等3种反相色谱柱进行比较。

结果表明,在其他色谱条件一致的情况下,Ultimate®XB-C4反相色谱柱可实现6种目标物的快速分离,而且峰形良好,与理论预期相符[13]。因此,试验选择Ultimate®XB-C4反相色谱柱。

2.2.2 流动相

流动相中添加盐溶液,可抑制目标物解离,确保色谱峰峰形良好。试验选择乙酸铵溶液和磷酸二氢钾溶液进行对比。结果表明:选用乙酸铵溶液时,ATP和ADP色谱峰拖尾严重,这是由于二者均含有碱性氨基,容易与键合相表面残余的硅醇基相互作用,并且仪器中的钢组件表面涂有金属氧化物,这些金属氧化物的活性位点易与活性分子相结合,而磷酸二氢钾溶液可有效降低上述两种作用力;进一步试验发现,当磷酸二氢钾溶液浓度为0.048 mol·L-1时,各目标物均可实现良好分离,不需要再添加磷酸氢二钾[14]。因此,试验选择流动相中的盐溶液为0.048 mol·L-1磷酸二氢钾溶液。

流动相中常用的有机溶剂为乙腈和甲醇,添加有机溶剂可缩短分析时间。与甲醇相比,在流动相中添加乙腈时,产生的鬼峰多、干扰大,而且乙腈成本高,毒性较大;并且本方法的检测波长为254 nm,甲醇的末端吸收不影响检测。综合考虑,试验选择流动相中的有机溶剂为甲醇。

2.3 前处理方法的选择

加入10%高氯酸溶液提取溶剂后,样品会出现结块现象,试验分别采用涡旋振荡法[14]和超声辅助提取法对样品进行处理,结果见图2。

图2 不同前处理方法对比Fig.2 Comparison of different pretreatment methods

由图2可知,采用超声辅助提取法时,ATP及其关联产物的测定值较高,并且超声波特殊的物理性质可有效破坏虾肉细胞,实现目标物的快速充分提取[15]。因此,试验选择的前处理方法为超声辅助提取法。

2.4 标准曲线、检出限和测定下限

按照仪器工作条件对混合标准溶液系列进行测定,以各目标物的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线,线性参数见表1。

分别以信噪比为3和10时对应的质量分数为检出限和测定下限,结果见表1。

表1 线性参数、检出限和测定下限Tab.1 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.5 精密度试验

2.5.1 仪器精密度

对ATP、ADP、IMP质量浓度为25.00 mg·L-1,AMP、Hx R、Hx质量浓度为12.50 mg·L-1的混合标准溶液连续进样6次,计算得6种目标物峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.28%～1.4%,表明仪器精密度良好。

2.5.2 重复性

取同一批样品,平行制备6份供试品溶液,按照仪器工作条件进行测定,计算得6种目标物测定值的RSD为3.5%～8.7%,表明该方法重复性良好。

2.6 回收试验

按照试验方法对新鲜对虾样品进行低、中、高等3个浓度水平的回收试验,结果见表2。对于超出线性范围的样品,稀释后再进样分析。

由表2可知,6种目标物的回收率为75.3%～114%,满足试验要求。

表2 回收试验结果Tab.2 Results of test for recovery

2.7 贮藏条件对K值的影响

按照试验方法测定不同贮藏温度和贮藏时间下对虾中ATP、ADP、AMP、IMP、Hx R、Hx的含量,按照公式(1)计算K值,结果见图3。

图3 贮藏条件对K值的影响Fig.3 Effect of the storage condition on the K value

式中:XATP、XADP、XAMP、XIMP、XHxR、XHx为样品中ATP、ADP、AMP、IMP、Hx R、Hx的质量摩尔浓度,mmol·kg-1。

由图3可知:随着贮藏时间的延长,对虾的K值逐渐增大;并且贮藏时间一定时,贮藏温度越低,K值增大速率越慢,说明温度越低,越有利于对虾的保鲜。

本工作以C4反相色谱柱为固定相,提出了超声辅助提取-反相高效液相色谱法测定虾中ATP、ADP、AMP、IMP、Hx R、Hx含量的方法,并以此计算对虾的K值。该方法操作简便、分析时间短、灵敏度高,适用于大批量样品分析。目前,关于C4色谱柱的应用报道较少,本工作研究表明C4色谱柱适用于核苷酸类化合物的快速分析,可为相关项目分析提供借鉴,同时为其他水产品的检测提供方法参考。