滋阴温阳序贯方对卵巢功能减退动物模型的调节作用

顾仁艳，何 丽，张秋梅，宋国宏，庞保珍

（1.新疆医科大学第五附属医院，乌鲁木齐 830011；2.聊城市中医医院，山东 聊城 252000）

卵巢功能减退（diminished ovarian reserve，DOR）是指卵巢产生卵子的功能降低，卵细胞质量下降的一类常见的女性内分泌临床疾病[1]。临床表现程度不一，可表现为无症状，月经不调，高流产率，不孕等[2-3]。随着病情发展可进一步发展为卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）与 卵 巢 早 衰（premature ovarian failure，POF）[4]。近年来卵巢功能减退的发生率呈现上升趋势和年轻化[5]。卵巢功能减退的影响因素复杂，发病机制尚不清楚。基因变化、免疫力降低、外部损伤、伤口感染、放化疗、心理因素、生活习惯等都可导致其发生发展[6]。现代医学对于卵巢功能减退的治疗手段缺乏，主要以心理辅导，生活方式改变和脱氢表雄酮、辅酶Q10、褪黑素等药物使用为主[7]，仅能改善部分临床症状，治疗效果不佳，不良反应较大。中医改善卵巢功能减退疗效肯定且无明显不良反应[8-10]。根据中医学理论，可将“卵巢功能减退”归类为“不孕”“月经后期”“月经过少”等范畴，主要病机为肾虚，多以补肾活血为主。本次研究所用滋阴温阳序贯方在临床治疗中可显著改善患者临床症状，但其作用机制尚不清楚。本次课题拟通过研究滋阴温阳序贯方治疗卵巢功能减退模型大鼠，从动物水平探讨滋阴温阳序贯方在卵巢功能减退疾病中的调节作用，为研究滋阴温阳序贯方的作用机制提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料 8～12 周龄SPF 级 SD 健康雌性大鼠，体质量（180±20）g，购自湖北省实验动物研究中心（许可证号：SCXK-2020-0018），动物质量合格证编号：42000600041829，新疆医科大学动物实验管理中心伦理委员会伦理审批号：IACUC202101113-01。普通级别安静环境中单笼饲养，相对湿度40%～70%，人工昼夜节律（白天夜晚各12 h），恒温（20±2）℃，自由饮水，自由摄食条件下适应性喂养1 周。TIANScript反转录试剂盒、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）实时荧光定量PCR 试剂购自北京天根生化科技有限公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；大鼠抗缪勒管激素（AMH）酶联免疫吸附检测试剂盒、大鼠雌二醇（E2）酶联免疫吸附检测试剂盒、大鼠促卵泡激素（FSH）酶联免疫吸附检测试剂盒、大鼠促黄体生成激素（LH）酶联免疫吸附检测试剂盒购自武汉elabscience 公司；IGF1 Antibody、SCF Polyclonal Antibody 购自美国Abcam 公司；微量移液器，酶标仪，thermo 购自美国；倒置显微镜，OLYMPUS购自美国；低速离心机，Eppendorf 购自美国；电子天平，赛多利斯购自中国；病理切片机，Leica RM 购自德国；组织摊烤片机、包埋机均购自武汉。滋阴温阳序贯方药滋阴方：熟地黄10 g，山药10 g，山茱萸10 g，女贞子10 g，旱莲草10 g，当归10 g，白芍10 g，麦冬10 g，沙参10 g，百合10 g。温阳方：淫羊藿10 g，仙茅10 g，巴戟天10 g，山药10 g，山茱萸10 g，菟丝子10 g，杜仲10 g，鹿角霜10 g，醋香附10 g，郁金10 g。上述中药材，均购于新疆医科大学第五附属医院免煎中药房制备的配方颗粒，厂家：三九医药股份有限公司。临用前使用双蒸水配成混悬液备用。滋阴方浓缩颗粒日用药量为17.651 g，相当于原生药100 g。温阳方浓缩颗粒日用药量为11.151 g，相当于原生药100 g。参考《中药药理研究方法学》中剂量换算方法“体表面积比”换算动物临床等效剂量，根据公式所得大鼠给药剂量，并以此设置为滋阴温阳序贯方药中药组，以10 mL/kg 灌胃。戊酸雌二醇片（补佳乐）：每片1 mg，由拜耳医药广州分公司提供，国药准字号 J20150009。参考《中药药理研究方法学》中剂量换算方法“体表面积比”换算动物临床等效剂量，大鼠用量为0.09 mg/kg。

1.2 实验方法 适应性喂养7 d 后，每日11:00 起对大鼠进行阴道脱落细胞学检测，连续10 d，光镜下观察，筛选出有规律动情周期为4～5 d 的健康雌性大鼠纳入正式实验。按照随机数表法将大鼠随机分为正常对照组、模型组、滋阴温阳序贯方药组（中药）和戊酸雌二醇片组（西药），共4 组，每组8 只。正常对照组大鼠常规饲养，予0.9% 氯化钠溶液2 mL，每日灌胃1 次，连续14 d。除正常对照组大鼠外均予雷公藤多甙片75 mg/kg 混悬液2 mL，每日灌胃1 次，连续14 d，建立卵巢功能减退动物模型[11]。各组均于造模后灌胃给药，正常对照组、模型组10 mL/kg灌胃0.9%NaCl；中药组均以10 mL/kg 灌胃给予滋阴温阳序贯方药，根据大鼠动情周期档案，按大鼠动情间期—动情前期—动情期—动情后期顺序，模拟人的月经周期循环用药，以动情期为界限，滋阴温阳序贯方药在动情前期先给予滋阴方灌胃，每日灌胃1 次，然后在动情后期序贯给予温阳方灌胃；西药组给予戊酸雌二醇片按0.09 mg/kg 灌胃给药。各组均每天灌胃给药1次，连续2 周。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 一般情况观察 开始给药后，分别在第1 天、第7 天、第14 天观察大鼠体质量，第14 天计算卵巢质量和卵巢系数。

1.3.2 病理检测 用4%多聚甲醛磷酸缓冲液固定卵巢组织标本，进而石蜡包埋、切片，经苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining,HE），染色后在光镜下观察组织病理变化。

1.3.3 ELISA 法检测AMH、FSH、LH、E2的表达变化 实验开始前，各试剂均应平衡至室温；试剂或样品配制时，均需充分混匀，并尽量避免起泡。加样：分别设正常对照孔、标准孔、待测样品孔。正常对照孔加样品稀释液100 μL，余孔分别加标准品或待测样品100 μL。给酶标板覆膜，37 ℃孵育90 min。弃去液体，洗板5 次，每孔加生物素化抗体工作液100 μL，加上覆膜，37 ℃温育60 min。弃去液体，洗板5 次，每孔加酶结合物工作液100 μL，加上覆膜，37 ℃温育30 min，弃去孔内液体，甩干，洗板5 次。每孔加显色剂（TMB）100 μL，酶标板加上覆膜37 ℃避光孵育15 min。每孔加终止液100 μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。立即用酶标仪在450 nm 波长测量各孔的光密度（OD 值）。

1.3.4 免疫组织化学法检测IGF-1 和SCF 的表达变化 切片常规脱蜡水化，加3% H2O2室温处理10 min，在枸橼酸盐缓冲液（pH=6.0）中微波加热10 min（92～98 ℃）进行抗原修复，冷却后5%小牛血清室温处理10 min，分别滴加1:100 稀释的IGF-1 和SCF一抗抗体，4 ℃孵育过夜，再分别滴加1:200 稀释的二抗，室温处理30 min，再加SP（1:100）工作液室温处理30 min，DAB 显色，苏木素复染，脱水，透明，封片后光镜下观察并摄片。

1.3.5 Western blot 法检测不同分组中蛋白表达情况 将少量组织块置于1～2 mL 匀浆器中球状部位，加400 μL 裂解液（含PMSF）于匀浆器中进行匀浆，重复碾几次使组织尽量碾碎，裂解30 min 后，在4 ℃，12 000 r/min 离心5 min，取适当稀释的上清液用BCA 法来测定蛋白浓度，调整蛋白质浓度后采用免疫印迹法（Western blot）检测组织内IGF-1 和SCF 的表达，其步骤大致如下：经过灌胶、加样、电泳、转膜后，将膜装入 5% BSA 封闭液，制置室温摇床 1 h，加5 mL 一抗稀释液（1:1 000）于4 ℃冰箱过夜。然后加10 mL 二抗稀释液（1:50 000）置于摇床上2 h，显色，在暗室中压片曝光显影，结果用 Quantity-one 图像软件分析并进行光密度值扫描，分别计算目的蛋白条带与GAPDH 强度比值（%）。

1.4 统计学方法 利用SPSS 25.0软件进行数据处理，所有数据采用均数±标准差（）表示，对计量资料进行单因素方差分析，采用LDS 法进行两两比较。

2 实验结果

2.1 一般情况 本研究发现，大鼠体质量在给药第1天、第7 天、第14 天时间点上西药组和中药组间差异无统计学意义，但均较对照组显著降低（P＜0.05），见表1。第14 天取卵巢组织，大鼠卵巢质量和卵巢系数变化比较，见表2。

表1 大鼠体质量变化（，n =8） g

表1 大鼠体质量变化（，n =8） g

注：与对照组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05

表2 大鼠卵巢质量及卵巢系数变化（，n =8）

表2 大鼠卵巢质量及卵巢系数变化（，n =8）

注：与对照组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05

2.2 病理变化 本次研究通过HE 检测不同分组中卵巢组织中卵泡、黄体、颗粒细胞的病理变化情况。实验结果显示，对照组小鼠各级卵泡数量较多，窦卵泡形态饱满，颗粒细胞完整。与对照组比较，模型组小鼠各级卵泡数量减少，颗粒细胞完整度破坏。与模型组比较，西药组和中药组小鼠卵巢内可见新生卵泡，颗粒细胞层数增加，见图1。

图1 不同分组大鼠卵巢组织病理变化

2.3 滋阴温阳序贯方调节E2、AMH、FSH 和LH 的表达水平 实验结果显示，在西药和中药干预后，E2与AMH的浓度含量较模型组显著升高（P＜0.05）。FSH和LH的浓度含量较模型组显著降低（P＜0.05）。见表3。该数据表明，中药和西药可以参与调控E2、AMH、FSH 和LH 的表达在卵巢退变过程中发挥作用。

表3 药物调节 E2、AMH、FSH 和 LH 的表达水平（，n =8）

表3 药物调节 E2、AMH、FSH 和 LH 的表达水平（，n =8）

注：与对照组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05

2.4 免疫组织化学检测IGF-1 和SCF 的表达变化 实验数据显示，西药和中药干预后，IGF-1 表达量显著高于模型组（P＜0.05），见图2；IGF-1 免疫组织化学原始图，见图3。SCF 表达量显著低于模型组（P＜0.05），见图4。SCF 免疫组织化学原始图，见图5。该数据表明，中药和西药可以通过调控大鼠卵巢中IGF-1 和SCF 表达在疾病中发挥作用。

图2 免疫组织化学法检测各组大鼠卵巢组织中IGF-1 蛋白表达情况比较

图3 IGF-1 免疫组织化学原始图

图4 免疫组织化学法检测各组大鼠卵巢组织中SCF 蛋白表达情况比较

图5 SCF 免疫组织化原始图

2.5 Western blot 检测IGF-1 和SCF 的表达变化 实验结果显示，不同分组中IGF-1 在西药和中药干预后，IGF-1 蛋白表达量显著高于模型组（P＜0.05），见图6。SCF 蛋白表达量显著低于模型组（P＜0.05），见图7。该数据表明，中药和西药可以通过调控大鼠卵巢中IGF-1 和SCF 表达在疾病中发挥作用。

图6 Western blot 检测各组大鼠卵巢组织中IGF-1 表达变化的比较

图7 Western blot 检测各组大鼠卵巢组织中SCF 表达变化的比较

3 讨论

卵巢功能减退主要表现为卵子数量和质量降低，卵巢功能减退[12]。相关研究表明，卵巢功能减退的发生伴随着激素异常分泌，主要以E2和AMH 的分泌水平降低，FSH 和LH 的分泌水平升高。这些激素的分泌水平可以有效地反映卵巢功能是否正常[13]。本次实验采用雷公藤多甙片造模，可以通过抑制卵泡颗粒细胞的活性来促使卵巢功能减退的发生。与对照组比较，模型组中E2、AMH 降低，FSH 和LH 升高，卵巢指数降低，卵泡细胞数量减少，颗粒细胞完整性破坏都证明了卵巢功能减退模型成功，与相关文献报道一致[11,14-15]。

关于卵巢功能减退的治疗一直是临床的热点和难点，现代医学尚无有效的提高卵巢功能的治疗手段，而中医的治疗效果斐然，相关研究报道表明可以提高卵子的数量和质量，改善卵巢功能减退的卵巢功能，但其作用机制尚不清楚[4,16]。中医学认为肾虚血瘀是导致卵巢功能减退发生发展的最主要原因。因此，将补肾活血作为卵巢功能减退的主要治疗手段[17]。万凌屹等[18]研究表明补肾活血可以改善卵巢的血液循环、提高卵巢功能，从而改善卵巢功能减退的临床症状。本次研究采用的滋阴温阳序贯方以补肾活血为主，通过对模型鼠的干预治疗后发现，大鼠激素水平得到明显改善，E2、AMH 升高，FSH 和LH 降低，卵巢指数升高，卵泡细胞数量增加，颗粒细胞层数较丰富，且与戊酸雌二醇片的治疗效果相当，表明了滋阴温阳序贯方能够有效增加卵泡数量和质量，改善激素分泌和卵巢功能。

SCF 是一类由卵巢分泌的细胞因子，对卵巢的发育发挥调控作用[19]。SCF 表达水平的异常升高会刺激诱导颗粒细胞的增殖与分化，对卵泡的早期发育起到重要的调控作用[20]。有研究报道表明，SCF 的高表达促进颗粒细胞的调控作用，引发卵巢功能减退[19]。IGF-1 是一类干细胞分泌因子，在卵巢中起到促进卵泡生长的功能[21]。于佳等[22]研究表明，IGF-1 的高表达可以促进原始卵泡发育，从而改善卵巢功能。本次研究结果显示，模型组的SCF 表达量升高，IGF-1 表达量降低，与上述报道一致。在滋阴温阳序贯方干预治疗后，SCF 的表达量降低，IGF-1 的表达量升高，且与戊酸雌二醇片的治疗效果相当，表明了滋阴温阳序贯方能够有效调控卵巢分泌细胞因子的能力，改善卵巢功能。

本实验所运用的“滋阴温阳序贯方”是以国医大师夏桂成教授的“调周法”[23]为理论指导，根据月经周期不同阶段的阴阳消长转化和气血盈亏变化规律，把握现代助孕手段的中医药治疗靶点及时机的不同，同时结合新疆“燥邪”偏盛地域特点创新提出的，以中医“金水相生”“肝肾同源”的基础理论为指导，简化用药方案，肺、肝、肾三脏同治。本研究结果表明，滋阴温阳序贯方可以通过增加卵巢系数、卵泡数量和质量，改善激素分泌和细胞因子表达，进而改善卵巢功能。