高效液相色谱法测定藜麦中芦丁含量

田旭静，崔小芳

（1.山西铁道职业技术学院，山西 太原 030013；2.山西锦烁生物医药科技有限公司，山西 晋中 030600）

藜麦是一种原产于南美洲安第斯中高海拔山区的藜科藜属植物，具有相当全面的营养物质，因此被赋予“营养黄金”的称号[1]。至今，藜麦已有几千年的种植和食用历史，藜麦不仅具有高蛋白，还富含对人体健康有利的多酚、皂苷、维生素等营养物质，被推荐为全谷全营养食品[2]。藜麦的营养品质受气候、土壤、种植条件等因素的影响，目前在山西、四川、陕西等地广泛种植。

芦丁是维生素P属的一类黄酮类化合物，可以通过清除氧自由基，进而对油脂过氧化作用产生明显的抑制作用，可用作开发新型食用油脂[3]。芦丁可以改善血管的功能，维持毛细血管的弹性，使血管的脆性和通透性降低，医学上可降低高血压、糖尿病、视网膜出血等一系列疾病的发生率。目前可以采用比色法、薄层扫描法、高效液相色谱法、紫外分光光度法等来测定芦丁的含量，其中效率最高、应用最广的方法是高效液相色谱法[4]。

高效液相色谱法（HPLC）是一种重要的分离检测技术，已作为食品、药品检验的重要方法之一。HPLC是采用高压输液系统，将流动相注入系统，样品通过进样系统随流动相进入分离系统，样品中各组分由于极性不同，在分离系统中实现分离，依次进入检测系统在相应条件下得到不同的响应值，依据响应值对样品中各组分进行定量分析。流动相可以为多种溶液按照规定的比例制作为混合溶液，也可以使用单一溶液的方式。分离系统有色谱柱和控温组成。HPLC技术和传统的色谱检验方法相比，具有检测自动化水平高，分析速度快、精度高的优势，精度能够达到0.01 ng，所以在食品检验领域价值高[5]。本试验采用高效液相色谱法测定藜麦中的芦丁含量，并对此方法的重复性、稳定性和精密度进行研究，旨在为进一步提取芦丁原料和筛选芦丁含量高的藜麦种质奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器

ASl0200AT超声波清洗器，天津奥特赛恩斯；Vanquish Core（VWD）高效液相色谱仪，赛默飞世尔科技有限公司；MILLIPORE超纯水器（美国密理博公司），电子分析天平（德国赛多利斯CP-224S）。

1.2 试剂

芦丁标准品（坛墨质检科技股份有限公司，纯度98.%），甲醇为色谱纯，超纯水，山西忻州静乐县藜麦。

1.3 色谱条件

采用Agela Technologies Venusil ABS C18柱，流动相为乙腈-水（2∶8），采用梯度洗脱，流速为0.8 mL·min-1，柱温为30℃，检测波长200 nm，进样量20μL。

1.4 芦丁标准溶液的配制

用天平准确称定芦丁标准品10 mg于量瓶中，加入甲醇溶液进行溶解，然后稀释定容至25 mL，摇匀，得到质量浓度为400μg·mL-1的芦丁标准品储备液。取适量储备液稀释成2μg·mL-1、4μg·mL-1、8μg·mL-1、35μg·mL-1、60μg·mL-1、120μg·mL-1质量浓度梯度，按前述色谱条件取20μL进样[6]。芦丁标准品的色谱图见图1。

图1 芦丁标准品色谱Fig.1 The standard chromatogram of rutin

1.5 样品处理

取藜麦样品80 g，先进行脱壳处理，然后置于40℃烘干箱中鼓风干燥3 h后研细，过0.25 mm筛，用天平精密称定5.0 g，加入50 mL甲醇溶液溶解于150 mL磨口锥形瓶中，密塞摇匀，超声提取30 min，再回流水解1.5 h，用甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，过滤，取一定量的提取液经0.45μm滤膜（Milipore，USA）过滤后，取20μL直接进样[7]。

2 结果与分析

2.1 标准曲线和线性范围

将芦丁标准溶液系列从低浓度到高浓度进行排序，根据试验方法分别进样20μL进行测定。标准曲线是以质量浓度x值为横坐标，以峰面积Y值为纵坐标绘制而成，见图2。结果可见，在2～120μg·mL-1芦丁标准品的质量浓度和相应的峰面积之间线性关系保持良好。线性回归方程为y=0.316 44x-0.068 1，相关系数r=0.999 9[7]。

图2 芦丁标准曲线Fig.2 The standard curve of rutin

2.2 加样回收率试验

用天平准确称定藜麦样品5 g（其中芦丁含量为2.83μg/g）共6份，分别置于量瓶中，将芦丁浓度为2μg·mL-1的标准品溶液以1 mL，15 mL的标准各加入3份于6份样品中。按照样品测定方法进行峰面积的测定和芦丁含量的计算[8]。由表1可以看出，芦丁的平均回收率为98.33%，相对标准偏差RSD为2.02%。

表1 回收率试验结果Tab.1 The recovery test results

2.3 样品的测定

按照上文1.5所述对样品进行处理，用天平精密称取6份样品，超声提取后将提取液进行过滤，分别取20μL直接进样。样品1～6的芦丁含量分别为2.76μg/g，2.81μg/g，2.74μg/g，2.84μg/g，2.88μg/g，2.71μg/g[8]。

2.4 精密度试验

取同一浓度芦丁标准品溶液，重复精密吸取5次各20μL，在1.3色谱条件下进样，将5次的峰面积值做好记录，结果表明5次峰面积值的RSD为1.22%，说明仪器具有良好的精密度[6]。

2.5 重复性试验

用天平准确称定藜麦样品5.0 g共5份，对样品处理后，进行提取制备，从5份样品提取液中各取20μL进样，进行5次峰面积值的测定和芦丁含量的计算，RSD为0.69%，说明本法重复性比较好[7]。

2.6 稳定性试验

选择藜麦样品溶液进行稳定性试验，分别在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h进样20μL测定，不同时间内的峰面积值见表2。结果表明藜麦样品中芦丁峰面积值的RSD为0.91%，表明该样品在12 h内具有较好的稳定性[6]。

表2 藜麦中芦丁稳定性试验结果Tab.2 The stability test results of rutin in Quinoa

3 结语

本试验结果表明，在2～120μg·mL-1范围内，芦丁标准品的质量浓度和相应的峰面积之间线性关系保持良好。线性回归方程为y=0.316 44x-0.068 1，r=0.999 9，平均加样回收率为98.33%，RSD为2.02%。其中重复性，稳定性，精密度均能符合试验要求，因此本试验方法测定芦丁方法可靠简便，适合于藜麦产品的质量标准检测。

在很多芦丁测定的研究中，样品中的芦丁一般采用乙醇或甲醇来进行提取[8]。本试验分别用乙醇和甲醇对藜麦中芦丁进行提取试验，结果发现，采用甲醇作为藜麦中芦丁的提取剂效果更好，样品的回收率、稳定性、重复性更符合试验要求[9]。同时测定藜麦种质的芦丁含量，筛选出芦丁含量比较高的藜麦种质，可为后续藜麦功能育种研究提供相关依据。