蕲艾精油提取工艺优化与抑菌活性成分分析

车明哲，王晨曦，侯柄竹，王红波，漆小泉

（1.中国科学院植物研究所，北京 100093；2.江汉大学生命科学学院，湖北 武汉 430056）

艾（Artemisia argyi）为我国传统的中草药，具有良好的散寒、温经止血、抗炎、抗菌、抗氧化和降血糖等生理功效[1-5]，其主要化学成分为挥发油类、黄酮类、酚酸类和糖类。研究显示，艾中挥发油类成分提供其主要的抑菌作用，包括5-苯基-1，3-丙二烯、茵陈素、樟脑、沉香醇、石竹烯氧化物、1，8-桉树酚、α-萜品醇-8和冰片等[6-11]。湖北蕲春生产的艾品质优良，特称为“蕲艾（Artemisia argyi var.argyi cv.Qiai）”。目前对蕲艾主要抑菌活性成分的研究还相对较少。

艾草精油的提取主要有传统的水蒸气蒸馏法（煎煮法）、超声波辅助提取法、冷压法、亚临界萃取法和超临界萃取法等[10]。水蒸气蒸馏法提取得到的有效成分主要是挥发油，因其操作简单、仪器简单等特点在实际生产中被广泛应用。有研究分别以50%乙醇、50%甲醇、50%石油醚、50%丙酮有机溶剂及蒸馏水作为溶剂对艾草进行精油提取，发现用水作为提取剂时艾草提取物对供试菌的抑菌圈直径最大，抑菌效果较好[12]。本研究采用水蒸气蒸馏法对2017年—2020年4年采集的蕲艾进行精油提取，通过单因素试验，对出油率影响较大的浸泡时间、料液比和提取时间3个因素进行考察，并在此基础上通过正交试验，获得蕲艾精油的最优提取工艺。此外，还利用GC-MS结合质谱检索标准库分析鉴定蕲艾精油的主要成分，并利用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌对蕲艾精油的抑菌效果进行评价。本研究为高效提取蕲艾精油提供了参考，为进一步研究蕲艾精油的有效抑菌成分及利用抑菌成分进行相关抑菌产品的开发提供一定的理论基础。

1 试验材料

1.1 蕲艾材料

本研究所有蕲艾材料均由湖北蕲艾堂科技有限公司采集及提供，具体包括2017年艾叶，2018年艾叶，2019年艾叶，2020年蕲艾粉和2020年艾绒。

1.2 供试菌种

ATCC25922大肠埃希氏菌（CGMCC 1.2385）；ATCC6538金黄色葡萄球菌（CGMCC 1.2465）；ATCC10231白色念珠菌（CGMCC 2.2086）。以上菌种均购于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）。

1.3 试验仪器

GC-MS仪由本实验室提供（Gas Chromatograph，7890B，Agilent Technologies；Mass Spectrometer，5977A，Agilent Technologies），检测结果通过Agilent分析软件Qualitative Analysis of MassHunter Acquisition Data进行化合物分析。

2 试验方法

2.1 蕲艾精油提取与水相提取方法

采用2010版《中国药典》一部附录XD甲法进行水蒸气蒸馏法浸提，提取装置和测量装置均为本实验室按照《中国药典》一部附录XD甲法采购并组建，装置由上至下依次为球形冷凝管、挥发油提取器、圆底烧瓶和电子加热器[13]。将物料粉碎后，准确称取质量，置于500 mL圆底烧瓶中，加入一定量蒸馏水，混合均匀后，浸泡，连接挥发油提取器与球形冷凝管。向挥发油提取器中加入蒸馏水使充满其刻度部分，直至从弯口溢出到圆底烧瓶。在电子恒温加热器中缓慢加热至沸腾，保持沸腾状态直至精油量不再增加。停止加热后根据精油量读取刻度，计算精油含量。待精油提取完成后，将圆底烧瓶内的料液过滤，得到蕲艾水相提取液。

2.2 蕲艾精油提取工艺优化

2.2.1 不同年份不同处理方式下蕲艾精油含量比较

采用上述方法对蕲艾粉、艾绒、不同年份的艾叶等材料进行精油提取测定，初步设定料液比1∶14，浸泡12 h，提取6 h，比较不同年份不同处理方式下艾叶精油含量。

2.2.2 单因素试验

精油提取率主要与浸泡时间、料液比、提取时间等3个因素有关。

（1）浸泡时间的考察。准确称取出油率最高年份的样品30 g，按照料液比1∶12的比例向圆底烧瓶中加入蒸馏水，分别浸泡0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h后，加热煮沸4 h，记录精油获得量并计算其出油率，每个条件重复3次。

（2）料液比的考察。准确称取出油率最高年份的样品30 g，按照料液比1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16的比例向圆底烧瓶中加入蒸馏水，浸泡12 h后，加热煮沸4 h，记录精油获得量并计算其出油率，每个条件重复3次。

（3）提取时间的考察。准确称取出油率最高年份的样品30 g，按照料液比1∶12的比例向圆底烧瓶中加入蒸馏水，浸泡12 h后，加热煮沸1 h、2 h、4 h、6 h、8 h，记录精油获得量并计算其出油率，每个条件重复3次。

2.2.3 正交试验

根据单因素试验结果，以节约原料和成本为前提，结合蕲艾精油得率，选择对精油得率影响较大的3个因素为正交因素，分别设定3个水平，建立L9（34）实验表安排试验[12]，以出油率为标准进行评价，各因素各水平重复3次。

2.3 蕲艾精油主要成分鉴定

将提取的艾叶精油以1∶36的比例溶于乙酸乙酯，气相色谱条件为：载气为氦气（99.99%），流速为1 mL/min，进样量1μL，进样口温度为240℃，分流比10∶1。程序升温：40℃保持2 min，以2℃/min升温至80℃，再以4℃/min升温至160℃，最后以5℃/min升温至240℃，保持2 min。质谱条件：电离方式为EI源，源温230℃，四级杆温度150℃，传输线温度280℃，电离电压70 eV，质量范围50～600 m/z全程扫描。质谱检索标准库为NIST库。GC-MS检测试验中每个样品均进行3次技术重复，每年样品均进行3次生物学重复。

2.4 抑菌试验

2.4.1 培养基制备

LB培养基（细菌）：胰蛋白胨10 g，酵母5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 000 mL，调pH值至7.4；固体LB培养基则需再加入15 g琼脂粉，或称取LB营养琼脂40 g，溶解于1 000 mL蒸馏水中。121℃高压灭菌15 min，分装或冷却至50℃左右时倾入无菌平皿备用。

沙氏葡萄糖培养基（真菌）：蛋白胨10 g、葡萄糖40 g、蒸馏水1 000 mL，调pH值至5.6；沙氏葡萄糖琼脂培养基则需再加入琼脂15 g，或称取沙氏葡萄糖琼脂培养基65 g，加热搅拌溶解于1 000 mL蒸馏水中。121℃高压灭菌15 min，分装或冷却至50℃左右时倾入无菌平皿备用。

2.4.2 菌种活化

将所有供试菌种接入斜面培养基，细菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌）置于37℃恒温培养箱内培养24 h，真菌（白色念珠菌）置于28℃恒温培养箱内培养48 h，连续转接3次培养后，置于4℃冰箱保存，备用。

2.4.3 菌液制备

将经平皿活化的待测菌株在无菌条件下用接种环挑取1环菌落，接入盛有液体培养基的250 mL锥形瓶中，于37℃、130 r/min振荡过夜，8 000 r/min离心10 min后加入无菌水，离心，重复洗涤2～3次，再加入适量无菌水配制成菌悬液，调节菌液浓度至106～107 cfu/mL，置4℃冰箱保存，备用。

2.4.4 抑菌试验

抑菌试验采用牛津杯法。将已灭菌的培养基加热到完全融化后，倾入无菌培养皿里，每平皿约加18 mL，冷凝，标记菌种、药物及其浓度，然后每皿均匀涂布菌液350～500μL，在培养基表面垂直摆放牛津杯，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙。每皿5孔（其中3孔为3种对照），牛津杯中定量加入药液20μL。合皿并贴封口膜。细菌（大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌）37℃培养24 h，真菌（白色念珠菌）28℃培养48 h，平板对光观察抑菌圈，每菌重复3次。

3 试验结果

3.1 不同年份不同处理方式下蕲艾精油含量比较

初步设定料液比1∶14，浸泡12 h，提取6 h，采用水蒸气蒸馏法对蕲艾粉、艾绒、不同年份的艾叶等材料进行精油提取测定，结果见表1。3种材料处理方式中，艾叶出油率最高。同时，在2017年—2019年3年的艾叶中，2017年艾叶出油率最好，出油率约为1.2%。上述结果说明在提取条件相同的情况下，年份越久的陈年艾叶中保留的难挥发精油成分越高。本研究后续相关试验均使用2017年蕲艾艾叶。

表1 不同年份不同处理方式下蕲艾精油量Tab.1 The amount of essential oil of Artemisia argyi under different treatment methods in different years

3.2 蕲艾精油提取单因素试验

3.2.1 不同浸泡时间对蕲艾精油得率的影响

浸泡时水分进入到细胞内，有助于将药材中组织膨胀，影响有效成分的流出。图1反映出蕲艾精油得率随着浸泡时间的增加而逐渐增加，在4 h时达到最大，随后提取量基本保持不变。在实际工业生产中按照节约时间及能源的原则，可认为艾叶在侵泡4 h时已达到完全浸透，可作为最佳浸泡时间。

图1 浸泡时间对蕲艾精油提取得率的影响Fig.1 The effect of soaking time on the extraction yield of Artemisia argyi essential oil

3.2.2 不同料液比对蕲艾精油得率的影响

料液比增大，能加快液固相的相对运动速度，也能促使有效成分流出。图2反映出随着不同料液比的增大，对蕲艾精油得率呈现出逐渐增大的趋势，直到料液比为1∶14时，平均精油得率基本稳定，因此可认为1∶14是最佳料液比，有利于蕲艾精油的提取。

图2 料液比对蕲艾精油提取得率的影响Fig.2 The effect of material liquid ratio on the extraction yield of Artemisia argyi essential oil

3.2.3 不同提取时间对蕲艾精油得率的影响

提取时间是影响精油得量的重要参数。图3反映出随着提取时间的延长，蕲艾精油得量逐渐增大，在提取时间为4 h时达到最大，且8 h时有微弱减小的趋势。加热时间过长会导致提取装置的热传递，使得挥发油提取器温度过高，部分精油随水分的蒸发会造成损失。

图3 提取时间对蕲艾精油提取得率的影响Fig.3 The effect of extraction time on the extraction yield of Artemisia argyi essential oil

3.3 正交试验

3.3.1 正交试验设计

根据单因素试验结果，每个因素选取3个水平按照表2进行正交试验。

表2 正交试验因素水平Tab.2 The composition analysis of Agkistrodon argyi Essential Oil in different years

3.3.2 正交试验结果

按照表2相关内容在各条件下进行蕲艾艾叶精油提取试验，得到各试验条件下蕲艾精油提取结果，如表3所示。

表3 正交试验及相应结果Tab.3 The orthogonal test and corresponding results

根据表3中的结果，比较极差R，极差越大，影响越大，得出正交因素的影响顺序为提取时间＞浸泡时间＞料液比，蕲艾精油提取工艺以A3B3C2为最佳，即浸泡6 h，提取6 h，料液比为1∶14的条件下，蕲艾艾叶精油出油率最大。

3.4 不同年份蕲艾艾叶精油成分比较

图4为不同年份蕲艾精油的GC-MS总离子图，通过质谱库搜索及查阅相关资料获得分析结果如表6所示（相对含量小于1.5%的均已舍去）。2017年蕲艾艾叶精油鉴定出30种成分，2018年艾叶精油鉴定出13种成分，2019年艾叶精油鉴定出25种成分。不同年份蕲艾精油中鉴定到9种相同的成分，且含量占比较高，如桉油精、樟脑、龙脑、石竹烯和石竹素、刺柏脑等。结合文献报道，桉油精[14，15]、樟脑[16]、龙脑[17]等均为具有抑菌作用，可作为未来蕲艾抑菌产品研发重点关注的抑菌活性成分，这3种成分在GC-MS中的保留时间分别为15.68 min、22.98 min、24.80 min。

表6 不同年份蕲艾精油成分分析表Tab.6 Composition analysis table of Artemisia Argyi Essential Oil in different years

图4 2017年—2019年蕲艾精油的GC-MS总离子图Fig.4 The GC-MS total ion diagram of Artemisia argyi Essential oil from 2017 to 2019

3.5 抑菌试验

牛津杯法抑菌试验结果显示，蕲艾精油和对应阳性对照对3种供试菌种均表现出较明显的抑菌效果，出现一定程度的抑菌圈；但水相（蕲艾黄酮、蕲艾酸、蕲艾多糖）的抑菌效果则不明显，没有抑菌圈出现（图5）。

图5 蕲艾精油、蕲艾水相（蕲艾黄酮、蕲艾酸、蕲艾多糖）及阳性/阴性对照对3种供试菌种的抑菌效果Fig.5 The Agkistrodon argyi Essential oil and water phase(Agkistrodon argyi flavone,Agkistrodon argyi acid,Agkistrodon argyi polysaccharide)and positive/negative control on the bacteriostatic effect of the three tested strains

4 结论与讨论

本试验通过对水蒸气蒸馏法提取蕲艾精油过程中3个影响因素的研究及对提取工艺流程进行优化，得出在蕲艾精油提取工艺中影响出油率的3个主要因素的关系为提取时间＞浸泡时间＞料液比，提取工艺以A3B3C2为最佳，即在浸泡6 h，提取6 h，料液比为1∶14的条件下，蕲艾精油提取量最大。GC-MS法检测到不同年份蕲艾精油的主要成分略有不同，2017年艾叶精油鉴定出30种成分，2018年艾叶精油鉴定出13种成分，2019年艾叶精油鉴定出25种成分。不同年份艾叶精油中占比较高的主要成分基本相同，本实验中2017年、2018年、2019年艾叶精油之间有9种相同的主要成分，分别是桉油精（Eucalyptol）、桧脑（Juniper camphor）、石竹烯（Caryophyllene）、石竹素（Caryophyllene oxide）、4-萜烯醇（Terpinen-4-ol）、α-松油醇（α-Terpineol）、崖柏酮（Thujone）、香芹醇（Carveol）、芹子烯（Selinene）。推测艾叶存放时间不同，精油中的易挥发成分略有不同，难挥发成分基本相同。相关文献报道显示，艾叶精油主要成分中的桉油精、樟脑、石竹烯和石竹素等均具有抑菌效果。本研究中的抑菌试验结果显示蕲艾精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌三种供试菌种均有不同程度的抑菌效果，但蕲艾精油中的有效抑菌成分及抑菌最小浓度还需进一步研究。