特殊医学用途全营养配方食品中亚油酸和α-亚麻酸的测定

杨涛，韦伟宁，原亚梅，陆业活，邓爱婕，滕丕合

广西弘山堂生物科技有限公司（南宁 530032）

特殊医学用途配方食品（Food for Special Medical Purposes，FSMP）简称特医食品，是指为了满足进食受限、消化吸收障碍、代谢紊乱或特定疾病状态人群对营养素或膳食的特殊需要，专门加工配制而成的配方食品[1]。特殊医学用途配方食品分为全营养配方食品、特定全营养配方食品和非全营养配方食品，该类产品必须在医生或临床营养师指导下，单独食用或与其他食品配合食用，其中特殊医学全营养配方食品可作为单一营养来源满足目标人群的营养需求[2]。

亚油酸的学名是9, 12-十八碳二烯酸，其化学式为C18H32O2，为无色油状液体，不溶于水，易溶于石油醚、甲苯等有机溶剂。由于人体无法合成亚油酸，必须通过食物额外补充或通过特定的前体物质形成来维持正常的生理功能，被称为人体必需脂肪酸[3]。胆固醇与亚油酸结合才能发挥正常的转运功能，人体一旦缺乏就可能引发代谢障碍，演变成动脉粥样硬化，从而引发心脑血管疾病[4]。α-亚麻酸为顺9，顺12，顺15-十八碳三烯酸，化学式为C18H30O2，是ω-3系列的必需脂肪酸，必需从体外摄取[5]。人体一旦缺乏，就可能导致自身免疫力下降、疲劳等症状的发生，特别是婴幼儿和青少年，如果在成长期间长期缺乏亚麻酸，会严重影响智力的正常发育[6]。

食品安全国家标准GB 29922—2013中规定适用于10岁以上人群的全营养配方食品中亚油酸的供能比应不低于2.0%；α-亚麻酸供能比应不低于0.5%，是特殊医学用途全营养配方食品中的必检项目[1]。特殊医学用途全营养配方食品成分复杂、组织状态多样、亚油酸和α-亚麻酸含量较低等因素都会给检测带来较大的难度，目前特殊医学用途全营养配方食品中亚油酸和α-亚麻酸的含量测定方法也未见报道。此次研究拟建立特殊医学用途全营养配方食品中亚油酸和α-亚麻酸含量测定方法，为本产品的质量控制提供有力的保障，也为特殊医学用途配方食品行业提供一定的技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

亚油酸甘油三脂（纯度≥99.0%，上海安谱实验科技股份有限公司）；α-亚麻酸甘油三脂（纯度≥ 99.0%，上海安谱实验科技股份有限公司）；甲苯（美国Fisher公司）；甲醇（美国Honeywell公司）；乙酰氯（德国Merck公司）；无水碳酸钠（国药集团化学试剂有限公司）；有机微孔滤膜（天津津腾实验设备有限公司）。

试验用特殊医学用途全营养配方食品来源于本公司研发设计。

1.2 仪器与设备

GC-2010 Pro气相色谱仪（日本岛津公司）；SPB-3全自动空气源和SPH-300氢气发生器（北京中惠普分析技术研究所）；MS3涡旋振荡器（IKA公司）；DCY-12S水浴氮吹仪（绍兴苏珀仪器有限公司）；HH-4数显恒温水浴锅（方科仪器常州有限公司）；AUW220D电子天平（日本岛津公司）；H1850高速台式离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制

亚油酸甘油三脂和α-亚麻酸甘油三脂混合储备液：分别称取亚油酸甘油三脂144.5 mg（精确到0.1 mg）和α-亚麻酸甘油三脂63.5 mg（精确到0.1 mg），用甲苯溶解，定容至10 mL的容量瓶中。于-10 ℃以下的冰箱中保存，有效期3个月。

混合标准系列工作液：分别准确吸取亚油酸甘油三脂和α-亚麻酸甘油三脂混合标准储备液0.05，0.10，0.20，0.50，1.00和2.00 mL，于15 mL干燥螺口玻璃管中，分别加入4.95，4.90，4.80，4.50，4.00和3.00 mL的甲苯。向试样中加入10%乙酰氯甲醇溶液6 mL，充氮气后，旋紧螺旋盖。振荡混合后于80±1 ℃水浴中放置2 h，期间每隔20 min取出振摇1次，水浴后取出冷却至室温。将反应后的样液转移至50 mL离心管中，分别用3 mL 6%的碳酸钠溶液清洗玻璃管3次，合并碳酸钠溶液于50 mL离心管中，混匀。以5 000 r/min离心5 min，取上清液经滤膜过滤后上机。

1.3.2 样品处理

试样测定液：称取混合均匀的特殊医学用途全营养配方食品试样约0.5 g（精确到0.1 mg），于15 mL干燥的螺口玻璃管中，加入5.0 mL的甲苯，混合均匀后向试样中加入10%的乙酰氯甲醇溶液6 mL，充氮气后，旋紧螺旋盖，振荡混合后于80±1 ℃水浴中放置2 h，期间每隔20 min取出振摇1次，水浴后取出冷却至室温。将反应后的样液转移至50 mL离心管中，分别用3 mL碳酸钠溶液清洗玻璃管3次，合并碳酸钠溶液于5 mL离心管中，混匀。以5 000 r/min离心5 min，取上清液经滤膜过滤后上机。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：岛津SH-Rtx-Wax毛细管柱，长度30 m，内径0.32 mm，膜厚0.5 μm。进样口温度270 ℃，检测器温度280 ℃，柱温控制采用程序升温，130 ℃为起始温度，以15 ℃/min升温至180 ℃，持续5 min，以10 ℃/min升温至220 ℃，持续2 min，以4 ℃/min升温至230 ℃，持续10.5 min。载气为N2，尾吹气流量30 mL/min，氢气流量40 mL/min，空气流量400 mL/min。进样体积1 μL，分流比100∶1。

2 结果与分析

2.1 样品处理方法

对脂肪酸的含量进行测定时，首先需要提取样品中的脂肪酸并进行甲酯化处理[7]。水解提取法是指样品经水解-乙醚溶液提取其中的脂肪后，在碱性条件下皂化和甲酯化，生成脂肪酸甲酯[8]；乙酰氯-甲醇法是指乙酰氯与甲醇反应得到盐酸-甲醇使其中的脂肪和游离脂肪酸甲酯化，用甲苯提取后，进行分离检测[9]；酯交换法是指将油酯溶解在异辛烷中，加入氢氧化钾甲醇溶液通过酯交换甲酯化，反应完全后，用硫酸氢钠中和剩余氢氧化钾，测定脂肪酸含量[10]。其中水解提取法过程繁杂、步骤较多、检测周期长，不适合大量样品的检测；酯交换法中氢氧化钾不能使样品中游离的脂肪酸及其盐甲酯化，适用于游离脂肪酸含量不大于2%的油脂样品；亚油酸和α-亚麻酸以包埋的形式添加到本样品中，且水分含量为3.42%，乙酰氯-甲醇法适用于含水量小于5%的乳粉试样，对脂肪酸以包埋形式添加的样品有更好的提取效率，能很大程度上提高检测分析的准确度[11]。因此文章采用乙酰氯-甲醇法进行样品的前处理，下图1为亚油酸和α-亚麻酸混合对照气相色谱图，图2为特殊医学用途全营配方食品气相色谱图。该方法空白样品无其他杂质的干扰，亚油酸和α-亚麻酸的分离度达到8.21，均能满足试验要求。

图1 亚油酸和α-亚麻酸混合对照气相色谱图

图2 特殊医学用途全营养配方食品样品气相色谱图

2.2 线性范围和定量限

将1.3.1小节中配制的混合标准系列工作液按浓度由低到高的顺序依次经气相色谱仪进行测定，以各组分的进样质量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），分别绘制标准曲线。在0.72～28.61 mg范围内亚油酸的回归方程为Y=38 433.85X-36 830.88，R2= 0.996 3具有良好的线性关系，在0.31～12.56 mg范围内α-亚麻酸的回归方程为Y=39 580.66X-15 560.57，R2=0.997 0呈现良好的线性关系。按1.3.2小节的方法处理样品后，以信噪比法（S/N≥10）来确定该方法的定量限，其中亚油酸的定量限为4.62 mg/100 g，α-亚麻酸的定量限为3.84 mg/100 g。下图3为亚油酸标准曲线图，图4为α-亚麻酸标准曲线图。

图3 亚油酸线性方程

图4 α-亚麻酸线性方程

2.3 精密度

取特殊医学用途全营养配方食品试样约0.5 g，按照1.3.2小节中的方法处理，平行制备7份，亚油酸甲酯转化为亚油酸的换算系数为0.956 7，α-亚麻酸甲酯转化为α-亚麻酸的换算系数为0.956 4，通过计算，气相色谱分析结果见下表1。亚油酸含量的平均值3.63 g/100 g，7份的相对标准偏差为1.27%；α-亚麻酸含量的平均值为0.37 g/100 g，7份的相对标准偏差为1.16%。亚油酸和α-亚麻酸含量的比值接近10∶1，与试样设计的理论比例一致，两者的相对标准偏差均小于2.0%，表明该方法试验结果准确，精密度良好。

表1 精密度试验结果

2.4 回收率

将精密度试验测得样品亚油酸和α-亚麻酸的平均值作为样品含量，设计50%，100%和150%三个水平的加标质量分数。亚油酸加标：准确称取样品约100 mg，在加入样品的同时分别准确吸取混合标准系列工作液0.1，0.2和0.3 mL每个水平平行制备3份，共9份，按1.3.2小节中的方法处理；α-亚麻酸加标：准确称取样品约500 mg，在加入样品的同时分别准确吸取混合标准系列工作液0.1，0.2和0.3 mL每个水平平行制备3份，共9份，按1.3.2小节中的方法处理。亚油酸的平均回收率为97.68%，9份的相对标准偏差为1.14%；α-亚麻酸的平均回收率为100.69%，9份的相对标准偏差为1.47%，均符合GB/T 27404—2008中附录1关于回收率的要求，表明该方法准确度良好[12]。表2为加标回收率试验结果。

表2 加标回收率试验结果

3 结论

特殊医学用途全营养配方食品作为长期单一营养来源时，能够满足目标人群每日的营养需求，是临床肠内营养治疗的重要组成部分，我国特医食品行业还处于早期的起步阶段，潜力巨大，是大健康领域的又一片蓝海[13]。虽然国家对企业的研发能力、生产能力、检验能力等产品注册相关条件设置了较高的准入门槛，但是也阻挡不了国内越来越多的企业进入这一行业的热情。亚油酸和α-亚麻酸都是人体必需脂肪酸，亚油酸在体内能转化为花生四烯酸，对于形成细胞结构、维持组织生理功能、合成磷脂等均具有重要作用[14]。α-亚麻酸在进入人体后在碳氢酶和碳链延长酶的作用下，在人体代谢中衍生为EPA和DHA等，有利于预防和治疗外周动脉等相关疾病[15]。α-亚麻酸完全靠从饮食中摄取，若摄取不足可能会导致心力衰竭等疾病[16]。特殊医学用途全营养配方食品中亚油酸和α-亚麻酸的供能比均有国家标准规定，属于必检项目，目前特殊医学用途全营养配方食品中亚油酸和α-亚麻酸的含量测定方法也未见报道。试验建立了气相色谱法同时分离检测特殊医学用途全营养配方食品中亚油酸和α-亚麻酸的检验方法。亚油酸出峰时间为14.21 min，α-亚麻酸的出峰时间为15.36 min，空白样品对检测无干扰，两者的分离度为8.21达到检测要求。亚油酸、α-亚麻酸分别在0.72～28.61 mg（R2=0.996 3）、0.31～12.56 mg（R2=0.997 0）范围内线性关系良好，亚油酸的线性方程为Y=38 433.85X- 36 830.88，α-亚麻酸的线性方程为Y=39 580.66X- 15 560.57。以10倍的信噪比计算方法定量限，亚油酸的定量限为4.62 mg/100 g，α-亚麻酸的定量限为3.84 mg/100 g。平行制备7份样品，样品中亚油酸和α-亚麻酸的含量分别为3.63和0.37 g/100 g，含量的相对标准偏差分别为1.27%和1.16%。设计50%，100%和150%三个水平的加标质量分数，每个水平平行测定3次，亚油酸的平均回收率为97.68%，9份的相对标准偏差为1.14%，α-亚麻酸的平均回收率为100.69%，9份的相对标准偏差为1.47%。综上所述，该方法基质干扰小、操作易行、精密度高、准确度好，适用于特殊医学用途全营养配方食品中亚油酸和α-亚麻酸的测定，能为本产品质量控制提供一定的科学依据。