蝉花延寿及抗氧化作用

孙长胜，徐振栋，沈佳奇

浙江泛亚生物医药股份有限公司（平湖 314200）

蝉花（Cordyceps chanhuaZ.Z. Li，F.G. Luan，Hywel-Jones，C.R. Li & S.L. Zhang，sp. nov.），是虫草科（Cordycipitaceae）、虫草属（Cordyceps）[1]的一种，是在我国有上千年利用历史的药食两用真菌，是寄生在蝉若虫上形成的一种虫生真菌。其主要成分有虫草素、虫草多糖、腺苷、甘露醇和麦角甾醇[2]，现代研究表明，其具有增强免疫力[3]、改善睡眠[4]、抗疲劳[5]、抗肿瘤[6]、镇静镇痛[7]等功能。2021年1月蝉花子实体获批新食品原料，成为继蛹虫草、广东虫草之后的第三个虫草类新食品原料。

现有的研究发现蝉花多糖对果蝇有延寿抗氧化的功效，但对单纯的蝉花子实体和孢子粉的延寿抗氧化功能还未有研究。此次研究将不同剂量不同蝉花产品添加到果蝇基础培养基中饲养果蝇，以探究不同剂量不同蝉花产品对果蝇寿命的延长作用，随后通过测定各组果蝇组织匀浆中超氧化物歧化酶（SOD）的活性及丙二醛（MDA）的含量来探究蝉花的抗氧化作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

试验动物：黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）W1118；蝉花子实体粉和孢子粉由浙江泛亚生物医药股份有限公司提供。

试剂：玉米粉、蔗糖、琼脂、酵母粉、冰醋酸、无水乙醚；SOD试剂盒、MDA试剂盒、TP试剂盒（上海抚生实业有限公司）。

1.2 主要仪器与设备

HPX-300BSH-3恒温恒湿培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）；ZHJH-C1214B超净工作台（上海智城分析仪器制造有限公司）；H2100R高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；ML304T分析天平（美国梅特勒-托利多公司）；Infinite 200 Pro多功能酶标仪（瑞士帝肯公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 果蝇培养基的配制

将10 g琼脂、80 g蔗糖、108 g玉米粉加入锅中，再加900 mL凉水，充分搅拌，使玉米粉分散均匀，后加热搅拌成糊状，停止加热，加入冰醋酸6 mL搅拌均匀，再加入溶于100 mL温水的10 g酵母粉，搅拌均匀，然后使用注射器将培养基注入培养管中，每管培养基高约2 cm（大约8 mL），用脱脂棉球塞上管口，报纸封口，于121 ℃高压蒸汽灭菌30 min，随后置于超净工作台冷却凝固培养基，再置于37 ℃烘箱烘20 h使水汽蒸发，即获得果蝇基础培养基。在基础培养基分装前加入特定量的样品混匀，即制成试验培养基。

1.3.2 不同蝉花产品对果蝇寿命影响的测定

在基础培养基中分别添加0.2%，1%和5%的蝉花孢子粉、子实体粉、混合粉（5%孢子粉+95%子实体粉，以该比例为蝉花孢子粉与子实体整体采收时的产品组成）饲养的果蝇为试验组，以仅用基础培养基饲养的果蝇为空白对照组。选取8 h内羽化成虫的果蝇，用乙醚麻醉后鉴别分离雌雄果蝇，装入培养管饲喂，每管10只果蝇，雌雄各设置3个重复，于25 ℃恒温60%恒湿培养，每天记录果蝇存活情况，最后统计果蝇平均寿命，半数死亡时间及最高寿命。

1.3.3 不同蝉花产品对果蝇体内SOD活性及MDA含量的影响

果蝇5%组织匀浆的制备：取不同培养基培养25 d后的果蝇，乙醚麻醉，称量其质量（精确到0.000 1 g），用0.9%的生理盐水充分研磨配制成5%的果蝇组织匀浆，并以4 000 r/min离心15 min，取上清液备用。果蝇组织中可溶性蛋白含量、SOD活力、MDA含量的测定均按试剂盒说明书进行操作。

1.3.4 数据统计分析

试验数据使用SPSS Statistics 17.0软件进行数据处理和分析，试验结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 对果蝇寿命的影响

以用基础培养基饲养的果蝇为空白对照组，以添加0.2%，1%和5%的不同蝉花产品饲养的果蝇为试验组，探究蝉花孢子粉和子实体对果蝇寿命的影响。试验结果如表1和表2所示。

表1 不同处理对雌果蝇寿命的影响

表2 不同处理对雄果蝇寿命的影响

对比表1空白对照组和剂量组的结果发现，对于雌果蝇来说，培养基中加入中、低剂量的孢子粉、子实体粉时，能极显著增加雌果蝇平均寿命和半数死亡时间（P＜0.01），且低剂量的效果更高，平均寿命提高率分别为21.31%和21.94%，半数死亡时间提高率分别为20.8%和22.48%。此外，添加低剂量的孢子粉和子实体粉还能显著增加雌果蝇最高寿命（P＜ 0.05），分别提高4.69%和8.33%。低剂量的混合粉也能极显著增加雌果蝇平均寿命和半数死亡时间（P＜ 0.01），提高率为14.39%和15.09%，不及纯子实体粉和孢子粉。以剂量组内比较结果来看，各蝉花产品对雌果蝇延寿作用并不随浓度的提高而增强，甚至在最高寿命方面有降低。

对比表2空白对照组和剂量组的结果发现，对于雄果蝇来说，除中、高剂量的孢子粉组外，其余各组均能不同程度地显著增加雄果蝇平均寿命和半数死亡时间（P＜0.05），且对平均寿命来说，各低剂量组的提升效果更好，分别提高19.92%，27.15%和19.19%；对半数死亡时间来说，孢子粉和混合粉组中低剂量组提升效果好，分别为25.41%和22.95%，子实体粉组为中剂量组提升效果最好，达30.33%。从最高寿命来看，仅有低剂量的子实体组能显著增加雄果蝇最高寿命（P＜0.05），提高率为20.99%。此外，与雌果蝇类似，各蝉花产品对雄果蝇的延寿作用也并不随浓度的提高而增强。

综合雌雄果蝇结果，蝉花子实体和孢子粉对果蝇寿命有提升作用，并且0.2%剂量的子实体组的提升效果最好。

2.2 对果蝇SOD活性和MDA含量的影响

将在各组培养基中培养了25 d的果蝇制成5%组织匀浆，按照试剂盒的方法测定组织匀浆的SOD活力和MDA含量。测定结果如表3和表4所示。

表3 不同处理对果蝇SOD活力的影响

从表3中可以看出，对于雌果蝇，只有0.2%孢子粉组和子实体组相比于空白对照组体内的SOD活力有显著提升（P＜0.01），分别比空白对照组提高了12.92%和14.07%，而中、高剂量的孢子粉反而显著降低了雌果蝇SOD活力。对于雄果蝇，0.2%孢子粉组和子实体组及1%子实体组比空白对照组对SOD活力有显著提升（P＜0.05），分别为5.53%，6.99%和4.96%，而中、高剂量的孢子粉组和混合组则显著降低了雄果蝇的SOD活力。从结果来看，果蝇SOD活力在低浓度的孢子粉和子实体粉组中提升效果最好，随着浓度升高，果蝇SOD活力呈下降趋势。

从表4结果来看，对于雌果蝇，仅0.2%子实体组能显著降低MDA含量（P＜0.05），降低了30.08%，其余低剂量组能降低，但效果不显著，并且5%孢子粉组还极显著地增加了MDA含量（P＜0.01）；对于雄果蝇，0.2%孢子粉组、子实体组和混合组及1%子实体组均能极显著降低果蝇体内MDA含量（P＜0.01），分别降低了42.34%，49.55%，36.94%和45.05%。其余各组效果均不显著。

表4 不同处理对果蝇MDA含量的影响

综合雌雄果蝇的SOD、MDA结果可知，蝉花孢子粉和子实体能提高果蝇体内SOD活性、降低MDA含量，且0.2%子实体组的效果最优。

3 结论

果蝇是双翅目果蝇属昆虫，因其世代周期短、繁殖速度快、寿命较短，且许多代谢途径、生理功能和发育阶段与哺乳动物相似等优势而作为模式动物常被用于抗衰老研究[8]。超氧阴离子自由基（O2-）是生物体代谢过程中产生的一种可攻击生物大分子的自由基，其能破坏细胞结构和功能，引起机体衰老或病变。超氧化物歧化酶（SOD）能清除超氧阴离子自由基（O2-），防止其损伤细胞[9]。氧自由基攻击细胞膜中的多不饱和脂肪酸时，会发生脂质过氧化作用，形成丙二醛（MDA）等脂质过氧化物[10]。因此SOD活力与MDA含量的测定结果能反映机体清除氧自由基的能力和细胞受氧自由基攻击的损伤情况[11]。在我国《保健食品功能学评价程序和检验方法》中将果蝇生存试验、过氧化脂质和抗氧化酶这三项指标的结果是否呈阳性作为判定保健食品是否具有延缓衰老功能的检验标准。

试验探究了蝉花不同产品不同添加量对果蝇寿命的影响，并以超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量为指标探究了其抗氧化活性。

在对果蝇寿命影响方面，0.2%添加量的孢子粉、子实体粉及混合粉和1%添加量的子实体粉均能显著提高雌雄果蝇的平均寿命和半数死亡时间（P＜0.05），0.2%子实体粉组能显著提高雌雄果蝇的最高寿命（P＜ 0.05）。其中，0.2%的子实体粉组综合效果最好，使雌雄果蝇平均寿命分别延长了21.94%和27.15%，使雌雄果蝇半数死亡时间提高了22.48%和25.41%，最高寿命提高了8.33%和20.99%。综合来看，孢子粉、子实体粉对果蝇寿命的延长不随剂量的增加而增加，只有在适当的浓度下才表现出显著的正向作用。上述结果表明，蝉花具有延长果蝇寿命的作用，且雌雄果蝇延寿效果显著时所需剂量偏低。

在抗氧化作用方面，0.2%添加量的孢子粉和子实体粉能显著提高雌雄果蝇体内SOD活力（P＜0.05），0.2%的子实体粉能显著降低雌雄果蝇体内MDA含量（P＜0.05）。0.2%的孢子粉能显著降低雄果蝇体内MDA含量（P＜0.05），对雌果蝇来说，虽能降低27.64%的MDA含量，但不够显著。综合来看，孢子粉、子实体粉对果蝇抗氧化作用的影响不随剂量的增加而增加，与寿命试验的结果一致。该结果表明，低剂量的蝉花子实体和孢子粉对雌雄果蝇均表现出抗氧化作用。

除蝉花之外，目前市面上还有如冬虫夏草、蛹虫草、广东虫草等虫草类产品被广泛使用。这些不同的虫草对果蝇寿命的影响均存在一定的研究报道，如：刘玉香[12]的研究发现，0.02，0.06和0.2 mg/mL的冬虫夏草口服液能分别提高雄果蝇平均寿命25%，31%和32%；闫文娟等[13]的研究发现，1%剂量的广东虫草子实体粉能延长果蝇寿命，雌雄分别延长10.97%和9.78%；王菊凤等[14]的研究发现浓度为0.15%的蛹虫草多糖可以使雌雄果蝇的平均寿命延长率分别达34.3%和11.24%，使雌雄果蝇的半数死亡时间延长率分别为61.76%和23%，且蛹虫草多糖对果蝇的延寿作用并不随多糖浓度的提高而增强；张明等[15]的研究发现，蛹虫草分级多糖P60能显著延长雌雄果蝇的最高平均寿命，分别为12.54%和14.02%，并能显著提高雌雄果蝇SOD活力6.95%和9.14%，降低MDA含量10.53%和27.07%；于士军等[16]发现蝉花孢梗束粗多糖有延寿和抗氧化作用，雌雄果蝇寿命延长率分别是18.78%和26.23%；邵颖等[17]发现蝉花孢梗束分级多糖P60能显著提高雌雄果蝇平均寿命、半数死亡时间、最高寿命和SOD活力（P＜0.05）；赵节昌等[18]研究发现1.0 mg/mL的蝉花孢子粉多糖可以显著提高雌雄果蝇的平均寿命、半数死亡时间和最高寿命（P＜0.05）；中、高剂量组蝉花孢梗束粗多糖均显著提高雌雄性果蝇的半数死亡时间和最高寿命（P＜0.05），且蝉花孢子粉和孢梗束粗多糖均具有提高果蝇体内SOD活力和降低MDA含量的效果。从上述研究结果中可以发现各种虫草均具有延寿和抗氧化的作用，有效成分可能为虫草多糖，有待进一步研究其中的有效成分及其作用机制。