植物乳杆菌高密度发酵

张国柱，宫俊峰，赵玉明，彭晓光，麻杰，王慕华*

1. 山西维尔生物乳制品有限公司（太原 030006）；

2. 山西省生物研究院有限公司医药生物技术山西省重点实验室（太原 030006）

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）为乳杆菌科乳杆菌属，同型发酵，最适生长温度为30～35 ℃，最适pH在6.5左右，兼性厌氧，耐盐、耐酸，是一种重要益生菌[1-2]，具有调节动物胃肠道菌群平衡、改善肠道内环境、增强免疫力和抵抗力等多种功能[3-7]，在食品、饲料及医疗保健等领域有着广泛应用[8-10]。获得植物乳杆菌高密度培养物对其商业化生产具有重要意义。不同发酵工艺对其生长有不同影响，通过培养基成分的优化获得高密度细胞是最为经济、有效的途径[11]。为充分发挥菌种的生产能力实现高产，不仅需要拥有一个良好的发酵培养基，还需要对发酵条件进行优化[12]。试验探究培养基成分对植物乳杆菌生长的影响，确定优化培养基配方。同时，对植物乳杆菌的培养方式、发酵温度、培养基初始pH、接种量进行研究，旨在获得植物乳杆菌的最佳发酵条件，提高菌体生物量，为植物乳杆菌高密度发酵提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

植物乳杆菌SX68（山西省生物研究院有限公司分离、保藏[12]）。

MRS液体培养基：蛋白胨10 g/L、牛肉浸膏5 g/L、酵母浸膏4 g/L、葡萄糖20 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、乙酸钠5 g/L、柠檬酸三铵2 g/L、硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.05 g/L、吐温80 1.0 mL/L，pH 6.5，用蒸馏水定容至1 000 mL，于121 ℃灭菌15 min。

MRS固体培养基：MRS液体培养基中加入20 g/L琼脂粉，于121 ℃灭菌15 min，用于活菌计数。

葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、磷酸氢二钾、乙酸钠、柠檬酸三铵、吐温80等（国产分析纯）；麦芽糖、可溶性淀粉、酵母粉、酵母浸膏、蛋白胨、牛肉浸膏、大豆蛋白胨、胰蛋白胨等（生物试剂）。

1.2 仪器与设备

BJ-2CD超净工作台（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；YXQ-70A立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；SPX-150B-Z生化培养箱（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；FE28-standard pH计（瑞士梅特勒-托利多公司）；MTV-1漩涡振荡器（杭州奥盛仪器有限公司）；DK-8D电热恒温水浴槽（常州诺基仪器有限公司）；UV-1500分光光度计（上海美析仪器有限公司）；C-32厌氧培养盒（日本三菱瓦斯化学株式会社）。

1.3 方法

1.3.1 参数测定

菌体生物量测定：培养液稀释适当倍数后，以稀释相同倍数同一批次灭菌而未接入菌种的MRS液体培养基为参照，经UV-1500分光光度计测600 nm波长处的吸光度。

活菌计数：采用平板菌落计数法，厌氧培养统计植物乳杆菌活菌数。

pH测定：FE28-standard pH计测定。

1.3.2 植物乳杆菌生长曲线绘制

将活化好的植物乳杆菌接种于MRS液体培养基中，在37 ℃下静置培养，每间隔2 h取样测定培养液pH和吸光度（A），绘制菌体生长曲线。

1.3.3 最佳碳源的确定

分别以20 g/L麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、葡萄糖、可溶性淀粉替换MRS液体培养基中的碳源，2%接种量，在37 ℃下三角瓶静置培养18 h，测定吸光度，确定最佳碳源；将最佳碳源分别以10，15，20，25和30 g/L的质量浓度加入MRS液体培养基中，在2%接种量、37 ℃下三角瓶静置培养18 h，测定活菌数，确定最佳添加量。

1.3.4 最佳氮源的确定

分别以20 g/L玉米浆干粉、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、牛肉浸膏替换MRS液体培养基中的氮源，在2%接种量、37 ℃下三角瓶静置培养18 h，测定吸光度，比较各氮源的影响。在此基础上，玉米浆干粉、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、蛋白胨中选最好的1种，酵母粉、酵母浸膏中选较好的1种，与牛肉浸膏组合形成最佳氮源复配方案，确定最佳组合中各氮源添加量。

1.3.5 缓冲盐、生长因子对植物乳杆菌发酵的影响

分别将缓冲盐2 g/L磷酸氢二钠、2 g/L磷酸氢二钾、5 g/L乙酸钠、2 g/L柠檬酸三铵或生长因子0.2 g/L硫酸镁、0.05 g/L硫酸锰单一加入MRS液体培养基中，在2%接种量、37 ℃下三角瓶静置培养18 h，测定吸光度，确定影响比较大的缓冲盐和生长因子。

1.3.6 发酵培养基优化

采用四因素三水平L9(34)正交表进行优化试验，将影响菌体生物量的主要因素碳源、氮源、缓冲盐和生长因子作为影响因素进行正交试验，以得到最佳发酵培养基配比。

1.3.7 发酵条件优化

采用四因素三水平L9(34)正交表进行优化试验，将影响菌体生物量的主要因素接种量、发酵温度、起始pH、溶氧量作为影响因素进行正交试验，以得到最佳发酵条件。

2 结果与讨论

2.1 植物乳杆菌MRS液体培养的生长曲线

植物乳杆菌接种于MRS液体培养基中，每间隔2 h取样测定发酵液pH和吸光度，绘制菌体生长曲线及pH变化情况曲线，如图1所示。

从图1中可知，植物乳杆菌在MRS液体培养基中，8 h进入对数期，18 h达到稳定期，pH由起始的6.5降到3.3。因此，可以确定植物乳杆菌的发酵时长达到18 h即可。

图1 植物乳杆菌生长曲线及培养过程中的pH变化曲线

2.2 不同碳源对植物乳杆菌生长的影响

麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、葡萄糖、可溶性淀粉替换MRS液体培养基中的碳源，发酵培养18 h后，测定吸光度，考察不同碳源对植物乳杆菌生长的影响，如图2所示。确定最佳碳源后，设定不同添加量，考察不同浓度对植物乳杆菌生长的影响，如图3所示。

图2 不同碳源对植物乳杆菌生长的影响

图3 不同蔗糖质量浓度对植物乳杆菌生长的影响

从图2中可知，麦芽糖、乳糖、蔗糖对植物乳杆菌生长的影响和葡萄糖差异不大，菌体生长量A600nm基本都在10左右，考虑到可将食品级蔗糖添加到培养基中，降低发酵成本，因此，选择蔗糖作为最佳碳源。从图3中可知，蔗糖添加量为25 g/L最适于植物乳杆菌的生长。

2.3 不同氮源对植物乳杆菌生长的影响

玉米浆干粉、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、牛肉浸膏替换MRS液体培养基中的氮源，发酵培养18 h后，测定吸光度，考察不同氮源对植物乳杆菌生长的影响，如图4所示。

图4 不同氮源对植物乳杆菌生长的影响

蛋白胨含有丰富的氨基酸，特别是含硫氨基酸较多，还含有细菌生长需要的维生素和其他生长因子，是各种培养基制备的基础原材料，主要作用是提供氮源；酵母膏含有氨基酸类、肽类、水溶性维生素、酵母多糖、酵母核酸等，在培养基中可补充氮源和提供细菌生长的各种维生素及氨基酸；牛肉膏含有肌酸、肌酸酐、多肽类、氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类的水溶性物质，在培养基中的主要作用是补充蛋白胨及其他氮源的营养不足。乳酸菌培养营养要求苛刻，因此考虑将3种氮源复配使用，以期达到较好的效果。从图4中可知，胰蛋白胨的效果优于其他2种蛋白胨，酵母膏和酵母粉效果差不多，选较便宜的酵母膏。按总添加量20 g/L计，胰蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏的比例分别设置1∶1∶1，2∶1∶1和3∶2∶1，比较不同氮源复配比例的影响，如图5所示。由图5可知，胰蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏按3∶2∶1的比例复配，最有益于植物乳杆菌的生长。

图5 不同氮源复配比例对植物乳杆菌生长的影响

2.4 缓冲盐、生长因子对植物乳杆菌生长的影响

在MRS液体培养基中分别只添加2 g/L磷酸氢二钠、2 g/L磷酸氢二钾、5 g/L乙酸钠、2 g/L柠檬酸三铵中的一种和0.2 g/L硫酸镁、0.05 g/L硫酸锰中的一种，考察不同缓冲盐、生长因子对植物乳杆菌生长的影响，如图6所示。

从图6中可知，缓存盐磷酸氢二钾、微量生长因子硫酸锰对植物乳杆菌生长的影响较大。

图6 不同缓冲盐、生长因子对植物乳杆菌生长的影响

2.5 发酵培养基优化

在单因素试验的基础上，以对植物乳杆菌生长影响较大的蔗糖、复配氮源（胰蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏3∶2∶1）、磷酸氢二钾、硫酸锰作为不同的因素，设计正交试验，进行发酵培养基配方优化，如表1所示。培养基中其他成分及添加量分别为乙酸钠5 g/L、柠檬酸三铵2 g/L、硫酸镁0.2 g/L、吐温80 1.0 mL/L。

表1 发酵培养基正交优化

从表1可知，不同因素对菌株高密度培养影响大小依次为蔗糖＞氮源＞硫酸锰＞磷酸氢二钾。最佳添加量为蔗糖25.0 g/L、氮源24.0 g/L、硫酸锰0.07 g/L、磷酸氢二钾2.0 g/L。氮源按胰蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏3∶2∶1分配为胰蛋白胨12 g/L、牛肉浸膏8 g/L、酵母膏4 g/L。最优培养基组成为胰蛋白胨12 g/L、牛肉膏8 g/L、酵母膏4 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、柠檬酸三胺2 g/L、乙酸钠5 g/L、硫酸镁0.58 g/L、硫酸镁 0.07 g/L、吐温80 1 mL/L、pH 6.4。用此培养基10 L发酵罐发酵，最高A600nm可达14.38，平板活菌计数，活菌量可达1.64×1012CFU/mL。

2.6 发酵条件优化

在10 L发酵罐单因素试验基础上，以生物量（A600nm）为评价指标，以接种量、发酵温度、起始pH、溶氧量作为影响因素，正交试验优化发酵条件，如表2所示。

从表2可知，不同因素对菌株高密度培养影响大小依次为起始pH＞发酵温度＞接种量＞溶氧。最佳发酵条件为起始pH 6.5，发酵温度35 ℃，接种量20 mL/L，溶氧量0 mL/L。确定最优发酵条件为起始pH 6.5、发酵温度35 ℃、接种量20 mL/L、溶氧量0 mL/L（控制低于100 mL/L），搅拌转速50 r/min，罐压0.03 MPa。在最佳发酵培养基配方及发酵条件下，最高A600nm可达15.72，活菌数可达9.63×1012CFU/mL。

表2 发酵条件正交优化

3 结论

通过植物乳杆菌生长曲线的绘制，可以确定其在MRS液体培养基中18 h进入稳定期，因此，在后续试验中可将18 h确定为发酵的终点。通过液体发酵培养基的优化，确定植物乳杆菌的最优发酵培养基配方：胰蛋白胨12 g/L、牛肉膏8 g/L、酵母膏4 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、柠檬酸三胺2 g/L、乙酸钠5 g/L、硫酸镁 0.58 g/L、硫酸镁0.07 g/L、吐温80 1 mL/L、pH 6.4。通过培养基配方优化，菌体生长量从MRS液体培养基中的A600nm的10.53提高到14.38，蔗糖可以替代葡萄糖作为碳源，节约生产成本。通过发酵条件的优化，最终确定植物乳杆菌的最优发酵条件：起始pH 6.5，发酵温度35 ℃，接种量20 mL/L，溶氧量0 mL/L（控制低于100 mL/L），搅拌转速50 r/min，罐压0.03 MPa。在最优发酵条件下，植物乳杆菌最高A600nm值可达15.72，活菌数可达9.63×1012CFU/mL，植物乳杆菌的菌体生物量提高显著。植物乳杆菌高密度发酵的研究为今后工业化生产植物乳杆菌奠定基础，具有较好的经济效益、社会效益和发展前景。