江苏部分地区奶牛乳腺炎病原菌流行病学调查及葡萄球菌耐药性分析

赵静雯，邵 雯，徐 崇，吴欣悦，3，李雅梅，杨 奕，徐天乐，3，杨章平，3*

(1.扬州大学 动物科学与技术学院，江苏 扬州 225000；2.上海申普兽医技术有限公司，上海 201512;3.扬州大学 农业科技发展研究院，江苏 扬州 225000；4.扬州大学 兽医学院，江苏 扬州 225000)

奶牛临床乳腺炎整体发病率较高，对奶牛健康、产奶量、乳品质均造成严重危害，且目前主流的抗生素治疗也面临着细菌耐药性增强、药物残留等问题，制约着产业发展[1-4]。本研究采集江苏不同地区牧场临床乳腺炎奶样316份，开展病原菌流行病学调查，利用细菌培养和16S rDNA PCR等方法对乳样中优势病原菌进行分离鉴定，同时，采用K-B药敏试验测定葡萄球菌耐药表型并分析其多重耐药特性。旨在阐明江苏地区奶牛临床乳腺炎病原菌流行情况，分析奶牛乳腺炎源葡萄球菌耐药特性，从而为有效降低奶牛临床乳腺炎发病率以及科学防治提供试验支撑。

1 材料与方法

1.1 奶样的收集及其方法于2020年4-12月，选择苏北(泗洪、新沂、淮安)、苏中(泰州、盐城)、苏南(张家港)7个规模化牧场，采集的临床乳腺炎奶样共计316份。采样前弃掉每个乳头的头3把奶，采集每1个乳头的乳汁，酒精消毒乳头周围，由远及近地消毒每个乳头，清洁15 s，晾干10 s。采样时：先从近端乳头开始收集牛乳，采集时注意尽量保持水平不要污染集乳瓶，采样量约40 mL。样品采集完成后密封采样瓶，24 h内带回实验室分析；采样瓶上编写牛号，另附纸质采样单写明牧场名称、采样时间，采样单序号与牛号相对应。

1.2 试验试剂哥伦比亚血琼脂基础培养基购自青岛高科技工业园区海博生物技术有限公司，货号：HB0124；无菌脱纤维绵羊血购自郑州九龙生物制品有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒和溶菌酶购自天根生化科技(北京)有限公司，型号：DP302；琼脂糖购自美国英杰生命技术有限公司，货号：75510019；2×Taq Master Mix(Dye Plus)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；DL5000 DNA Marker购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；Mueller-Hinton琼脂购自青岛高科技工业园区海博生物技术有限公司，货号：HB6232；药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司，青霉素G(10 μg/片，货号：S1001)，阿莫西林(20 μg/片，货号：S1061)，苯唑西林(1 μg/片，货号：S1002)，庆大霉素(10 μg/片，货号：S1028)，四环素(30 μg/片，货号：S1036)，林可霉素(2 μg/片，货号：S1053)，环丙沙星(5 μg/片，货号：S1050)，氯霉素(30 μg/片，货号：S1063)；麦氏比浊管购自北京索莱宝科技有限公司，货号：YA0180。

1.3 细菌分离与纯化取乳腺炎奶样50～100 μL均匀涂布于血平板，37℃培养箱，倒置培养15 min，待奶渍干燥后正置过夜培养。根据细菌颜色、形状、溶血性等表观特性做好记录。接种针挑取单菌落接种至营养肉汤培养基，37℃、180 r/min振荡培养8～12 h。接种环蘸取浑浊菌液，于LB琼脂上划线培养(分区划线、连续划线)，然后用接种针挑取单菌落振荡培养8～12 h。

1.4 病原菌基因组DNA提取TIANamp Bacteria DNA Kit试剂盒提取分离单一菌株的全基因组DNA。

1.5 PCR反应体系与程序PCR采用50 μL反应体系：2×Taq Master Mix 22.5 μL；上、下游引物各2.0 μL(10 μmol/L)；细菌基因组DNA 1.0 μL；RNase-free H2O2，22.5 μL补足反应体系。PCR反应程序：98℃ 2 min；98℃ 10 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s,35个循环；最后延伸72℃ 1 min。PCR引物见表1。

表1 病原菌扩增细菌16S rDNA通用引物

1.6 电泳与测序鉴定取PCR扩增产物5 μL点入琼脂糖凝胶(1%)上进行电泳，恒压120 V，25 min后将凝胶放置凝胶成像系统观察并拍照。取1 500 bp PCR产物，进行胶回收后进行测序(南京擎科生物科技有限公司)。测序结果在NCBI上与GenBank数据库进行BLAST比对分析，确定病原菌种属。

1.7 细菌药物敏感性试验挑取纯培养的菌落到灭菌生理盐水，调节其浓度为0.5麦氏单位。灭菌棉签沾取菌悬液，均匀涂布在9 cm M-H培养基平板上，菌液吸附数分钟后，再用灭菌镊子将药敏纸片逐一贴于培养基的表面，37℃培养18 h后，用游标卡尺测定抑菌圈直径并记录。结合2013版CLSI判读标准，将所有菌株试验结果分为敏感(S)、中度敏感(I)和耐药(R)。

2 结果

2.1 奶牛临床乳腺炎乳样致病菌分离情况本研究采用传统微生物培养法和16S rDNA鉴定相结合，对采集到的316份临床乳腺炎乳样进行致病菌分离鉴定。结果显示，共有274份乳样长出细菌，42份奶样未得到可用于分离鉴定的细菌，其中31份无细菌生长，11份乳样被污染，样品得菌率为86.71%(表2)。

表2 316份临床乳腺炎奶样致病菌分离情况

2.2 乳腺炎致病菌感染模式分析分析细菌感染模式发现，在有细菌生长的274份奶样中，单种细菌感染的乳样数量为86份，单菌感染率为31.39%；多种细菌感染的奶样数量为188份，混合感染率为68.61%(图1)。

图1 274份阳性样本病原菌感染模式

2.3 奶牛临床乳腺炎源致病菌种类分析274份奶样中共分离出细菌453株，经鉴定得到结果如下：共分离出葡萄球菌属132株，占分离株总数的39.13%，包括腐生葡萄球菌31株、产色葡萄球菌29株、松鼠葡萄球菌20株、金黄色葡萄球菌13株、溶血葡萄球菌11株、模拟葡萄球菌10株和其他种属葡萄球菌18株；克雷伯菌属80株，占分离株总数的17.66%，包括肺炎克雷伯菌72株、产酸克雷伯菌8株；大肠杆菌52株，占分离株总数的11.48%；芽孢杆菌属69株，占分离株总数的15.23%(图2)。另外还有一些常见的奶牛乳腺炎病原菌因数量较少，本研究将其纳入其他种属中，包括链球菌属(主要为无乳链球菌和乳房链球菌)、绿脓杆菌、鲍曼不动杆菌和肠球菌。

图2 453株分离株微生物多样性分析

2.4 103株葡萄球菌对8种抗生素耐药表型分析从图3可以看出，江苏地区奶牛乳腺炎葡萄球菌分离株对除环丙沙星外的7种抗生素均产生了一定的耐药性，耐药率为2.6%～82.5%，其中对林可霉素耐药最为严重，耐药率达82.5%，其次是β-内酰胺类的苯唑西林、青霉素、阿莫西林，耐药率分别达到67.6%，57.5%，43.2%。对庆大霉素、氯霉素、四环素较为敏感，耐药率为8.1%，5.4%，2.7%。试验中并未发现对环丙沙星耐药的菌株，但中度敏感的菌株比例较高，达27%。

图3 103株葡萄球菌耐药表型比例

2.5 103株葡萄球菌的多重耐药性情况从图4可以看出，江苏地区奶牛乳腺炎葡萄球菌分离株呈现多重耐药现象，其中3重耐药最多，为35株，占比达33.98%；其余依次为4重耐药、2重耐药、5重耐药，分别为21，16，14株，另外还有9株6重耐药。其中多以耐β-内酰胺类抗生素居多，说明江苏地区奶牛乳腺炎葡萄球菌分离株以耐β-内酰胺类抗生素为主的多重耐药现象较为严重。

图4 103株葡萄球菌对8种抗生素的多重耐药情况

3 讨论

在许多地区，环境型机会病原菌已成为奶牛发生临床乳腺炎的最常见原因[5]。OLIVEIRA等[6]研究则显示大肠杆菌和克雷伯菌属是最主要的两种环境型机会病原菌。进一步查阅资料发现，大肠杆菌引起的临床乳腺炎通常以基于急性的和有效免疫反应的短期临床乳腺炎为特征[7-8]。相反，由克雷伯菌属引起的临床乳腺炎与长期亚临床乳腺炎以及临床预后较差有关[9]。在探究江苏地区克雷伯菌属高流行率的原因时发现，本研究选取的牧场大部分采用木屑、锯末作为奶牛垫料，而根据国内外研究报告显示木屑、锯末垫料中克雷伯菌属的检出率远远高于沙子垫料[10-12]，且也有研究报道使用新鲜的沙层来控制乳腺炎的益处[13]。因此，对于克雷伯菌属高发的牧场来说，提高牧场卫生条件的同时，更换沙子垫料可能是个不错的选择。

本研究中检测的酵母菌主要为白色念珠菌(白色假丝酵母菌)，是一种条件致病菌，在机体处于健康状态时，白色念珠菌以不致病的状态维持寄生的动态平衡，当平衡被打破，白色念珠菌便开始产生致病性，对机体健康产生影响；另外白色念珠菌具有很强的传染性，由其引起的乳腺炎与其他原因引起的乳腺炎之间并无明显区别，故往往被忽视[14]。近年来国内外关于白色念珠菌引起的乳腺炎的相关报道一直存在，引起广泛关注。本研究中白色念珠菌主要在5、6月份检出，这与唐国春[15]的结果一致，可能是因为此时天气闷热多雨，适合霉菌生长。因此建议对于白色念珠菌高发的牧场，临近这个季节，应做好牛场清洁工作，定期对挤奶工具、医疗器械等进行消毒，防止该菌流行。

牛支原体通常被分类为一种传染性乳腺炎病原体,牛群之间的传播主要发生在挤奶时[16-18]。通常会引起亚临床或轻度的临床乳腺炎，严重的临床乳腺炎暴发也可能发生[19-20]。此外牛支原体乳腺炎不能用抗生素治疗。本研究中牛支原体的检测结果多为弱阳性，说明其不是引起奶牛乳腺炎的优势病原菌，但较高的检出应引起牧场注意。现阶段针对牛支原体的控制策略是保持牛群不受感染，并及时隔离感染的奶牛，防止大规模传播[21-22]。

通过分析103株奶牛乳腺炎源葡萄球菌的药敏结果可发现，目前江苏地区奶牛乳腺炎源葡萄球菌对林可霉素、β-内酰胺类药物表现出极高的耐药性；另一方面，虽然这些分离菌株对庆大霉素、环丙沙星等其他抗生素表现出较高的敏感性，但中度敏感的却不在少数，有进一步发展为耐药的趋势。通过查阅资料，发现江苏地区乳腺炎源病原菌对林可霉素、β-内酰胺类抗生素一直保持着较高的耐药率。江静宜[23]对江苏3个牧场分离出的病原菌进行药敏试验后发现，几乎所有分离菌对林可霉素和β-内酰胺类的氨苄西林、青霉素耐药，而对环丙沙星、庆大霉素和链霉素敏感。冯清[24]的结果显示，江苏部分地区分离出的114葡萄球菌对β-内酰胺类抗生素青霉素G的耐药率最高，达75.18%。林伟东[25]对江苏5个规模化牧场分离的393株葡萄球菌的研究结果显示，84.73%的葡萄球菌对青霉素耐药，是耐药性最强的抗菌药物。此外，在实地采样与牧场兽医交流时得知，林可霉素、青霉素、头孢菌素是牧场一线用药，这也解释了为什么江苏地区乳腺炎源病原菌对这些药物表现出高耐药率。

综上，江苏地区部分牧场乳腺炎的发病率仍然较高，流行病学调查结果揭示了乳腺感染多以葡萄球菌属和肺炎克雷伯菌为主要致病菌。其中，葡萄球菌属的耐药表型以多重耐药为主(三重)，结果证明，在抗生素使用广泛的牧场，耐药致病菌的产生是导致乳腺炎发病率高且难以治愈的主要原因之一，研究数据可为有效降低奶牛临床乳腺炎发病率以及科学防治提供试验支撑。