上海地区学龄前儿童对羟基苯甲酸酯类物质暴露与肺功能的相关性研究

户 宜，丁国栋

1.上海交通大学医学院附属儿童医院生物医学信息研究中心，上海 200040；2.上海交通大学医学院附属儿童医院呼吸科，上海 200040

对羟基苯甲酸酯类物质，因其广谱抗菌、安全性能好、低毒性和低成本的优势，作为防腐剂被广泛地应用到食品、药品和个人护理品当中［1-2］。常用的对羟基苯甲酸酯类物质包含羟基苯甲酸甲酯（methyl 4-hydroxybenzoate，MeP）、对羟基苯甲酸乙酯（ethyl 4-hydroxybenzoate， EtP）、 对 羟 基 苯 甲 酸 丙 酯（propyl 4-hydroxybenzoate，PrP）、对羟基苯甲酸丁酯（butyl 4-hydroxybenzoate，BuP）和对羟基苯甲酸苄酯（benzyl 4-hydroxybenzoate，BzP）等［3］。

在日常生活中，对羟基苯甲酸酯类物质可通过消化道、呼吸道和皮肤接触等多种途径进入人体［4］。对羟基苯甲酸酯类物质在人体代谢后主要经由尿液排出，检测其在尿液样本中的浓度常用于评估人体对羟基苯甲酸酯类物质的内暴露水平［5］。近年来，国内外多篇文献报道［6-8］指出，包括儿童在内的普通人群尿液样本中对羟基苯甲酸酯类物质检出率高，引发对其潜在健康风险的担忧。儿童对环境污染物易感性高、呼吸系统发育尚不成熟、免疫功能较低，对羟基苯甲酸酯类物质对其健康的影响受到广泛关注［9］。国外流行病学研究［10-12］发现儿童对羟基苯甲酸酯类物质暴露可能会损害呼吸系统，增加儿童哮喘发作风险等，但国内尚无相关报道。肺功能是呼吸系统生理功能的真实反映［13］，其定量检测结果是儿童呼吸系统疾病临床诊断的重要依据之一，并在呼吸生理科学研究中占据重要地位［14］。基于此，本研究拟通过检测上海市学龄前儿童对羟基苯甲酸酯类物质暴露水平，测定其肺功能指标，分析对羟基苯甲酸酯类物质暴露与儿童肺功能的相关性，以期为探讨对羟基苯甲酸酯类物质毒性效应及对儿童健康风险评估提供参考依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2019年8月—2020年1月在上海交通大学医学院附属儿童医院儿童保健科门诊招募的学龄前健康儿童为研究对象。纳入标准：5～7 岁身体健康的儿童；父母至少一方为上海市常住人口。排除标准：儿童有严重心脑血管疾病、遗传代谢性疾病及外伤史；近2 周内有发热、咳嗽、喘息等呼吸系统症状；有哮喘疾病史及相关用药史；监护人拒绝签署知情同意书，不愿意参加此次调查。在取得儿童家长同意后，对家长进行问卷调查。问卷内容包括儿童和父母基线资料、家庭环境情况等信息。最终，研究纳入136 名5～7岁学龄前儿童。

1.2 尿液样本收集和对羟基苯甲酸酯类物质检测

用无菌无酶的聚丙烯杯收集学龄前儿童随机尿液50 mL，分装至15 mL 无菌无酶的聚丙烯冻存管（美国Corning公司），后立即放置于-80 ℃超低温冰箱冷冻保存。采用Ao 等［15］建立的高效液相色谱串联质谱法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）检测儿童尿液中5 种对羟基苯甲酸酯类物质（MeP、EtP、PrP、BuP和BzP）的水平。尿样解冻后经β-葡萄糖醛酸酶水解，用乙酸乙酯液液萃取方法进行提取，使用Agilent Poroshell 120 EC-C18 色谱柱进行梯度分离，最终用HPLC-MS/MS进行进样分析。

对羟基苯甲酸酯类物质检测时，随机选择2 名儿童的尿液混合均匀，作为空白质控样本。在检测过程中每间隔25 个样本设置1 个空白质控样本、1 个低浓度质控样本（1 μg/mL） 和一个高浓度质控样本（100 μg/mL），用以检测分析性能。所有批次的质控样本对应的目标化合物回收率的范围均在80%～120%内。MeP、EtP、PrP、BuP 和BzP 的检出限（limit of detection， LOD） 分 别 为0.002、 0.005、 0.000 5、0.002 和0.003 μg/L。尿液中对羟基苯甲酸酯类物质水平低于LOD 时用LOD/ 2 表示对应物质的水平［15］；根据LOD 计算检出率，检出率＜75%的对羟基苯甲酸酯类物质不纳入统计分析。

为减少尿液浓稀程度对对羟基苯甲酸酯类物质检出水平的影响，使用尿肌酐对对羟基苯甲酸酯类物质水平进行校正。尿样样本从-80 ℃冰箱中取出后室温溶解，8 947×g离心1 min；取0.2 mL上清液，放入全自动生化分析仪（7100 Hitachi，日本）进行尿液肌酐的检测。

1.3 肺功能检测

采用肺功能仪（型号MasterScreen PFT System，JAEGER，德国）进行儿童肺功能检测。检测前对家长详细讲解肺功能检测的方法及注意事项，检测过程中确保儿童情绪稳定、周围环境安静，在儿童良好配合的情况下完成肺功能检测。检测指标包括：用力肺活量（forced vital capacity，FVC）、1 s用力呼气容积（forced expiratory volume in one second， FEV1）、FEV1/FVC 和最大呼气流量（peak expiratory flow，PEF）、呼气中段流速（forced expiratory flow between the 25th and 75th percentile of forced vital capacity，FEF25-75）。肺功能检测结果重复测定3次，3次结果差异＜5%为合格；选取3 次结果的最佳值（呼吸曲线最平稳）作为最终检测结果。

1.4 敏感性分析

为验证结果稳定性，依据2007 世界卫生组织颁布的5～19 岁儿童生长标准［16］，参照“同年龄、同性别儿童体质量指数（body mass index，BMI）＞生长标准中位数2 个标准差为肥胖”标准排除肥胖儿童后，在正常体质量儿童中进行敏感性分析。

1.5 统计学分析

采用Epidata 3.0 软件进行数据录入，应用SPSS 20.0软件进行统计学分析。符合正态分布的定量资料使用描述，符合偏态分布的定量资料使用百分位数P25、P50、P75、P90或者P50（P25，P75）描述；定性资料使用n（%）进行描述。使用Spearman 相关性分析计算对羟基苯甲酸酯类物质之间的关联强弱。采用秩和检验比较不同性别儿童之间肺功能指标的差异。由于肌酐校正后，对羟基苯甲酸酯类物质水平和肺功能指标为偏态分布，在纳入多元回归前先进行log 转化，然后采用多元线性回归探讨对羟基苯甲酸酯类物质暴露与儿童肺功能的相关性。参考相关文献报道［9-10，17-18］，选取年龄、性别、身高、体质量指数（body mass index，BMI）、早产和家庭年收入作为混杂因素。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 学龄前儿童人口学信息

在纳入研究的136 名5～7 岁儿童中，5 岁67 名（49.3%），6 岁34 名（25.0%），7 岁35 名（25.7%），平均年龄（5.76±0.84）岁；男性59 名（43.4%），早产儿11 名（8.1%），肥胖儿童13 名（9.6%）；在家庭年收入方面，16 名（11.8%）儿童家庭年收入＜10 万元/年，51 名（37.5%）儿童家庭年收入10～30 万元，66 名（48.5%）儿童家庭年收入≥30 万元/年，此外有3 名（2.2%）儿童家长拒绝回答该问题。儿童身高和BMI分别为（117.29±8.15）cm和（15.78±2.86）kg/m2。

2.2 学龄前儿童对羟基苯甲酸酯类物质的暴露水平

学龄前儿童尿液中对羟基苯甲酸酯类物质MeP、EtP、PrP、BuP 和BzP 的 检 出 率 分 别 为97.8%、86.8%、99.3%、77.9%和11.8%（表1）。其中，肌酐校正前MeP、EtP、PrP 和BuP 水平的中位数（P50）分别16.42、2.08、0.64 和0.04 μg/L。经肌酐校正后，MeP、EtP、PrP和BuP水平的中位数（P50）为36.12、3.88、1.50 和0.06 μg/g。BzP 因检出率仅为11.8%而不纳入后续统计分析。

2.3 学龄前儿童肺功能检测结果

136 名学龄前儿童肺功能检测结果见表2。其中，FVC、FEV1、FEV1/FVC、PEF 和FEF25-75的P50（P25，P75）分别为1.16（1.01，1.39）L、1.02（0.84，1.20）L、86.65%（80.89%，91.04%）、1.96（1.60，2.30）L/s和1.06（0.75，1.38）L/s。通过秩和检验比较不同性别儿童肺功能指标是否存在差异，结果显示男性的FVC 和FEV1显著高于女性（P＜0.05），但不同性别儿童FEV1/FVC、PEF 和FEF25-75差异未发现统计学意义（P＞0.05）。

表2 学龄前儿童肺功能指标结果（n=136）Tab 2 Distributions of pulmonary function measures in preschool children（n=136）

2.4 学龄前儿童对羟基苯甲酸酯类物质的Spearman相关性

通过Spearman相关性分析计算各种对羟基苯甲酸酯类物质之间相关性（表3）。结果显示，4种对羟基苯甲酸酯类物质之间均呈显著正相关（P＜0.05），其中MeP与PrP正相关最强（rs=0.56），然后依次为EtP与BuP（rs=0.38）、MeP与EtP（rs=0.28）、PrP与BuP（rs=0.20）、MeP与BuP（rs=0.16）和EtP与PrP（rs=0.15）。

表3 学龄前儿童对羟基苯甲酸酯类物质的Spearman相关性（n=136）Tab 3 Spearman's correlation among parabens in preschool children（n=136）

2.5 学龄前儿童对羟基苯甲酸酯类物质暴露与肺功能的相关性

在校正年龄、性别、身高、BMI、早产和家庭年收入等混杂因素后，多元线性回归的结果显示，儿童尿 液 中MeP 与FVC （β=-0.018，95%CI-0.035～-0.001）、PrP 与FEV1（β=-0.032，95%CI-0.051～-0.013）、BuP 与FVC（β=-0.018，95%CI-0.034～-0.002）以及BuP与FEV1（β=-0.021，95%CI-0.041～-0.001）均呈显著负相关（表4）。排除13 名肥胖儿童后，在123 名正常体质量儿童中重新分析对羟基苯甲酸酯类物质暴露与肺功能的相关性作为敏感性分析，结果与表4基本保持一致。

表4 学龄前儿童对羟基苯甲酸酯类物质暴露与肺功能的相关性（n=136）Tab 4 Association between paraben exposure and pulmonary function in preschool children（n=136）

3 讨论

本研究发现上海地区学龄前儿童尿液对羟基苯甲酸酯类物质检出率高，其中MeP 和PrP 检出率达到97.8%和99.3%，提示上海地区学龄前儿童可能普遍暴露于对羟基苯甲酸酯类物质。其中，儿童MeP、EtP、PrP 和BuP 的中位数水平分别为16.42、2.08、0.64、0.04 μg/L。经比较发现，本研究检出的对羟基苯甲酸酯类物质的水平高于任璐等［8］报道的广州幼儿园儿童的水平（MeP 和EtP 的尿液中位数水平分别为4.42 和1.39 μg/L），但是低于美国产前维生素D 降低哮喘试验（Vitamin D Antenatal Asthma Reduction Trial，VDAART） 研 究［19］中460 名 儿 童 的 水 平（MeP 和PrP 中位数为62.8 和6.8 μg/L），以及美国国家健康与营养调查（National Health and Nutrition Examination Survey，NHANES）研究［20］中1 324 名儿童的水平（MeP 和PrP 中位数为52.4 和5.5 μg/L）。与国外研究相比，我国儿童尿液中对羟基苯甲酸酯类物质水平相对较低，这可能与不同国家地区在防腐剂使用量存在差异有关［2］。此外，本研究发现4种对羟基苯甲酸酯类物质之间均呈显著正相关（P＜0.05），其中MeP 与PrP 正相关最强（rs=0.56），这与一项欧洲研究［21］中发现儿童尿液中MeP 与PrP 呈强正相关（rs=0.79）保持一致，这一现象可能跟MeP 和PrP 经常以联合的方式加入食品、药品和化妆品有关［2，8］。

对羟基苯甲酸酯类物质因为其在人体代谢快、不易蓄积而一度被认为对人类相对安全［22］。然而，越来越多的动物研究证据［23］表明对羟基苯甲酸酯类物质具有潜在的环境内分泌干扰作用，可通过雌激素和抗雄激素作用损害人体健康。近年来，有流行病学研究［9，12，23-25］指出儿童对羟基苯甲酸酯类物质暴露与呼吸系统不良结局有关，但研究相对较少且结论不一致。例如，Quirós-Alcalá 等［9］基于NHANES 开展的横断面研究发现儿童尿液中MeP 和PrP 浓度每增加10 倍，男孩出现哮喘急诊就诊行为的风险分别增加2.61 （95%CI1.40～4.85） 倍 和2.18 （95%CI1.22～3.89）倍。但是，美国［24］和日本［25］的2项病例对照研究却未发现儿童对羟基苯甲酸酯类物质暴露与哮喘的关联。现有研究大多关注儿童哮喘，不同研究之间哮喘定义和分组方式不同可能与结论不一致有关。因此，在儿童对羟基苯甲酸酯类物质暴露对呼吸系统影响的研究中引入具有定量检测结果的肺功能十分必要。据我们所知，目前仅有欧洲一项名为人类生命早期暴露组（Human Early-Life Exposome，HELIX）的研究［12］分析儿童对羟基苯甲酸酯类物质暴露对肺功能的影响，该研究者发现儿童EtP 暴露与FEV1呈显著负相关（β=-0.05，95%CI-0.10～-0.01）。本研究发现儿童MeP 和BuP 暴露与FVC 呈显著负相关，PrP和BuP 暴露与FEV1呈显著负相关。本研究与欧洲HELIX 研究结果均提示儿童对羟基苯甲酸酯类物质暴露与肺功能指标呈负相关。尽管现有肺功能证据较少，考虑到儿童普遍暴露于对羟基苯甲酸酯类物质且其呼吸系统发育尚不成熟，仍需高度重视对羟基苯甲酸酯类物质对儿童呼吸系统特别是肺功能指标的影响。

本研究选取上海地区小样本学龄前儿童为研究对象，通过检测尿液样本中对羟基苯甲酸酯类物质水平、探讨其与儿童肺功能指标的相关性，为了解上海地区学龄前儿童该类物质暴露水平及评估其对儿童健康风险提供了参考依据。但本研究尚存在一定局限性。首先，样本量相对较少，人群代表性有限。其次，采集的是儿童随机尿液样本。尽管对羟基苯甲酸酯类物质水平已进行尿肌酐校正，但仍可能存在暴露偏倚。最后，本研究为横断面研究，在确定因果关联时受限，未来仍需进一步验证对羟基苯甲酸酯类物质暴露与儿童肺功能的关系。

综上所述，本研究发现上海地区学龄前儿童对羟基苯甲酸酯类物质检出率较高，对羟基苯甲酸酯类物质暴露与儿童肺功能指标呈负相关。未来开展大样本、多中心和多时点的对羟基苯甲酸酯类物质暴露评估，可更精准地反映其在我国学龄前儿童的实际暴露情况；此外，通过前瞻性随访儿童肺功能指标，探讨儿童对羟基苯甲酸酯类物质暴露对呼吸系统的影响，可为评估儿童健康风险提供更多参考依据。

利益冲突声明/Conflict of Interests

所有作者声明不存在利益冲突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

伦理批准和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究涉及的所有试验均已通过上海交通大学医学院附属儿童医院伦理委员会的审核批准［审批号2019R046-E02，日期2019-08-05］。研究对象的监护人已经签署知情同意书。

All experimental protocols in this study were reviewed and approved by Shanghai Children's Hospital，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine （approval letter No.2019R046-E02，dated 08/05/2019）. Consent letters have been signed by the guardian of research participants.

作者贡献/Authors'Contributions

丁国栋、户宜参与研究设计；户宜、丁国栋参与论文写作和修改；所有作者均阅读并同意了最终稿件的提交。

The study was designed by DING Guodong and HU Yi. The manuscript was drafted by HU Yi and revised by DING Guodong.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-03-29

·Accepted：2022-07-06

·Published online：2022-08-08

参·考·文·献

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