甘南牦牛乳中蛋白类活性物质

罗丽 ，崔广智 ，苏德亮 ，李亚萍 ，宋礼

1. 甘南牦牛乳研究院（甘南 747000）；2. 甘肃华羚乳品股份有限公司（甘南 747000）；3. 甘肃羚华食品检测技术服务有限公司（兰州 730000）

牦牛是生活在高海拔地区的特殊物种，是中国的特色资源，中国现有牦牛超过1 400万头，占世界牦牛总数量的85%以上[1]。甘南牦牛主要分布在我国合作、玛曲、碌曲、夏河、卓尼及迭部[2]。与普通牛乳相比，牦牛乳中含有更高的蛋白质、脂肪、乳糖、矿物质等营养物质，且富含免疫球蛋白、转化生长因子、外泌体等多种免疫相关成分，具有天然、纯净、绿色的特点，是一种天然“浓缩乳”[3-5]。随着牦牛乳研究的深入和牦牛乳产业的发展，研究牦牛乳中免疫活性物质如免疫球蛋白、A2-β-酪蛋白等营养物质的含量和相互关系对提高牦牛乳质量、促进牦牛乳精深加工、提高牦牛乳附加值具有重要意义。

关于牦牛乳研究的报道较多，但不同地域、不同品种牦牛乳中营养物质含量差异很大，且缺乏对甘南牦牛乳蛋白类活性物质的深入研究，不利于指导企业开发甘南牦牛乳，采用双抗夹心酶联免疫技术研究甘南地区牦牛乳中蛋白类活性物质绝对含量及相关性，了解甘南不同地区牦牛乳中微量蛋白含量的特点，为进一步研究甘南牦牛乳各组分的结构和促进甘南牦牛乳的合理利用、功能性食品开发等提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

牦牛奶（分别采自甘肃省甘南州夏河县、卓尼县、合作市）；酶联免疫吸附测定试剂盒：α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、免疫球蛋白（IgA、IgD、IgE、IgG、IgM）、乳铁蛋白、乳清蛋白、血清白蛋白、A2-β酪蛋白（均购自上海酶联生物科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

IF 50酶标仪（瑞士帝肯）；PW 812板洗机（汇松全自动酶标板洗机）；XW-80A涡旋混合器（其林贝尔）；TD-6M离心机（四川蜀科仪器有限公司）；37 ℃恒温培养箱（上海一恒）；96微孔酶标板；高精度加样器及枪头。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

取冷冻牦牛乳样品，在流水下解冻，将不同地区各样品于涡旋混合器振荡5 min充分混匀，分别吸取2 mL各牦牛乳样品，在4 ℃条件下按5 000 r/min离心15 min，去除脂肪，吸取并保留上清液，即为乳蛋白样品。

1.3.2 测定方法

不同地区牦牛乳样品中α-乳白蛋白（α-LA）、β-乳球蛋白（β-Lg）、免疫球蛋白（IgA、IgD、IgE、IgG、IgM）、乳铁蛋白（LTF）、乳清蛋白（WP）、血清白蛋白（ALB）、A2-β酪蛋白（β-CNA2）分别使用双抗夹心ELISA试剂盒测定。

从室温平衡60 min后的铝箔袋中取出所需板条，设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加50 μL不同浓度的标准品，样本孔中加入50 μ待测样本L，空白孔不加。样本如需稀释，按照要求用试剂盒配套样本稀释液稀释样本。每孔加入50 μL生物素标记抗体，用封板膜封住反应孔，在37 ℃水浴锅温育30 min，标准孔空白孔不加，用洗板机重复洗板5次。除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入100 μL过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体，用封板膜封住反应孔，在37 ℃水浴锅温育30 min，用洗板机重复洗板5次。每孔加入底物A、B各50 μL，在37 ℃避光孵育15 min。每孔加入50 μL终止液，15 min内在450 nm波长处测定各孔的吸光度（A），记录检测结果。

1.4 数据分析

1.4.1 绘制标准曲线

在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应吸光度作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度。

1.4.2 检测数据分析

各测定指标的原始数据经过Excel工作表整理后进行统计分析，采用SPSS软件用邓肯氏法进行差异显著性检验进行分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

以标准样品浓度为y轴，吸光度为x轴绘制标准曲线，得到α-LA、β-Lg、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、LTF、WP、ALB、β-CNA2的标准曲线回归方程：y=89.401x-3.448 9，R2=0.998 6；y=123.96x-3.594 3，R2=0.998 4；y=23.468x-1.543 3，R2=0.997 9；y=259.68x-15.04，R2=0.997 3；y=201.24x-8.338 9，R2=0.993 9；y=296.21x-19.515，R2=0.999 9；y=1 133.8x-46.838，R2=0.997 4；y=309.63x-20.72，R2=0.994 7；y= 28.784x-1.530 3，R2=0.992 9；y=67.428x-3.471 2，R2=0.999 3；y=230.67x-11.09 8，R2=0.999 1。通过标准曲线来定量待测样品中的浓度。由各标准曲线方程可以看出，相关系数R均大于0.99，标准曲线呈现较好的线性关系，表明试验结果可靠。

2.2 最佳稀释倍数确定

各样本牦牛乳中α-LA、β-Lg、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、LTF、WP、ALB、β-CNA2的含量不同，测定时应对奶样进行一定倍数的稀释，以确保测定结果在标准样品浓度范围内。各蛋白检测样本稀释倍数如表1所示。

表1 最终稀释倍数

2.3 不同地区牦牛乳α-LA、β-Lg、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、LTF、WP、ALB、β-CNA2的含量分析

将测得的27份牦牛乳样的吸光度代入相应的标准曲线方程，得到样本中各蛋白的绝对含量平均值，如表2所示。

表2 牦牛乳中各蛋白绝对含量平均值

有研究表明，致敏性蛋白主要有β-乳球蛋白、α-酪蛋白和β-酪蛋白，与牦牛乳相比，普通牛乳中β-乳球蛋白是牦牛乳中的5倍，所以牦牛奶致敏性更低，可作为婴幼儿配方奶粉的优质原料[6-7]。由图1可以看出，甘南地区牦牛乳中含量较高的有免疫球蛋白（IgG、IgM）、A2-β酪蛋白以及乳清蛋白，含量偏低的有血清白蛋白、免疫球蛋白IgA和乳铁蛋白，因此，试验结果与上述研究结论一致。为考察不同地区间牦牛乳含量的差异性，进行方差分析。

采用SPSS软件用邓肯氏法进行方差分析，各地区牦牛乳间蛋白含量的方差分析结果见表3。

由方差分析表3中显著性水平值可见，β-Lg、IgA、IgD、IgG、IgM、ALB、β-CNA2在不同地区牦牛乳中含量平均数不具有显著差异（P＞0.05），α-LA在不同地区牦牛乳中含量平均数具有显著差异（P≤0.05），IgE、LTF、WP在不同地区牦牛乳中含量平均数具有极显著差异（P＜0.01）。为比较各地区之间α-LA、IgE、LTF、WP含量的差异程度，进行各地区间平均数的多重比较（Duncan法），检验结果见表4。

表3 不同地区牦牛乳中各蛋白含量的方差分析表

表4 不同地区牦牛乳中含量平均值的多重比较表

由表3多重比较结果可知：夏河牦牛乳中α-LA含量最低，为1.211 mg/mL，合作牦牛乳中α-LA最高，为1.476 mg/mL，夏河牦牛乳与卓尼牦牛乳中α-LA含量不具有显著差异，卓尼牦牛乳与合作牦牛乳中α-LA含量不具有显著差异，夏河牦牛乳与合作牦牛乳中α-LA含量具有显著差异；夏河牦牛乳中IgE含量最低，为3.70 mg/mL，合作牦牛乳中IgE最高，为6.71 mg/mL，夏河牦牛乳、卓尼牦牛乳、合作牦牛乳中IgE含量之间均具有显著差异；卓尼牦牛乳中LTF含量最低，为0.597 mg/mL，合作牦牛乳中LTF最高，为1.009 mg/mL，夏河牦牛乳、卓尼牦牛乳、合作牦牛乳中LTF含量之间均具有显著差异；夏河牦牛乳中WP含量最低，为4.48 mg/mL，合作牦牛乳中WP最高，为8.53 mg/mL，夏河牦牛乳、卓尼牦牛乳、合作牦牛乳中WP含量之间均具有显著差异。

3 结论

蛋白类活性物质（乳清蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、免疫球蛋白、乳铁蛋白、血清白蛋白、A2β-酪蛋白）在甘南地区牦牛乳中的含量差异基本保持一致，均呈现为免疫球蛋白（IgG、IgM）、A2-β酪蛋白以及乳清蛋白含量较高，血清白蛋白、免疫球蛋白IgA和乳铁蛋白含量较低，其免疫球蛋白和A2-β酪蛋白含量分别为28.57±2.44 mg/mL和5.82±0.39 mg/mL。甘南不同地区牦牛乳中，α-LA、IgE、LTF、WP含量存在显著差异，但均表现为合作牦牛乳中α-LA、IgE、LTF、WP含量最高。研究表明，甘南牦牛乳是一种营养价值高的乳制品，其免疫球蛋白含量、A2-β酪蛋白具有明显优势。随着牦牛乳中蛋白质组成和含量的进一步研究，牦牛乳可作为独特、高营养价值的功能型食品的原料，为牦牛乳制品加工提供理论数据。