抗马链球菌马亚种组方加味优选及其体内抑菌作用研究

朱怡萱，刘诗芃，张 伟，李金荣，彭 菲，林 娜，王语嫣，刘丹丹

(1.新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052；2.满洲里海关技术中心，满洲里 021400)

马腺疫是一种以呼吸道感染、咽后淋巴结脓肿为特征的马属动物传染病[1],马链球菌马亚种作为其主要致病菌，最早于1888年被分离鉴定，属于兰氏分群C群β溶血型链球菌，革兰氏染色呈紫色，单个菌体呈圆球状，通常成对或短链状存在，在含有5%绵羊血清的培养基上生长良好，有明显的β溶血环[2]。马链球菌马亚种传染性极强，导致马腺疫的发病率居高不下[3]，其发病是否与季节相关，目前仍存在争议，因为各国所处的气候带不同，英国、印度的气候对马链球菌马亚种流行影响较小[4-5]，在加拿大其冬季发病率高[6-7]，在巴基斯坦早春发病率高[8]，在中国每年的9月至来年4月期间发病率高[9]。从2015至2017年的血清学调查中发现，新疆地区每年厂区马腺疫的阳性率均可达20%以上[10-13]，对当地马养殖产业造成严重的经济损失。近年来，马腺疫治疗主要采取抗生素结合排脓的方法进行，但因长期使用抗生素造成菌株耐药、食品安全等一系列公共卫生问题[10，14]。因此寻找一种疗效好、低残留的天然药物迫在眉睫[15]。

马腺疫在中国流行时间可追溯甚远，在诸多马病名著中均有记载，书中也描述了马腺疫的病因症候。《元亨疗马集》中记载“因蓄养失调，喂饮无节，春不抽六脉之血，夏失灌清凉之药，以致气血太盛，热积心胸，传之与咽喉，故成其患[16]。”由此可知，马腺疫主要是因为心胸积热、气血紊乱所致。目前对于马腺疫的治则是“泄心肺、清咽喉、补气养血”[17]，围绕该治则也有相应的中药组方，如：黄芪散[18]、仙方活命饮[18]、清咽利膈汤[18]、阎超山祖传秘方[19]、加味黄茂散[20]、六神青黛散(含服)[21]等，但多为临床经验自拟，存在以下几个问题：试验动物数量有限，治疗效果不具有代表性；中药组方毒性不明确；最佳给药浓度无定值；这些因素导致上述组方并没有在临床治疗上广泛应用，使其在国内外的推广应用面临巨大困难。基于此，本研究根据中兽医辨证理论，选取了多味具有凉血解毒、逐瘀通经、降热止咳、安神止痛、益气养血的中药，通过中药对马腺疫主要致病菌——马链球菌马亚种的体外抑菌试验，结合正交试验设计以及模型动物(小鼠)体内抑菌试验，筛选治疗马腺疫的最佳组方，以期为临床选用中兽药治疗马腺疫提供参考，为中兽药研发及相关的马属动物疾病基础研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 标准菌株：马链球菌马亚种(Streptococcusequisubspeciesequi，S.equi)(ATCC9528)由新疆农业大学中兽医实验室保存；试验菌株：马链球菌马亚种是由昭苏地区患马腺疫马匹的鼻拭子中分离得到的强毒株。

1.1.2 动物 80只6周龄SPF级昆明小鼠，体重为20 g±2 g，雌雄各半，购自新疆医科大学实验动物中心(【SCXK(新)2018-0002】【SYXK(新)2018-0003】)，饲养于新疆农业大学动物实验室，饲养期间各组小鼠自由饮水，饲喂Co60辐照实验鼠维持饲料(美迪森生物【苏饲证(2018)10030】)。饲养环境：恒温恒湿，所有操作均符合新疆农业大学动物医学实验伦理要求(审批号：2019018)。

1.1.3 药材 浙贝母(2109158)、大黄(2201080)、苦参(2104064)、山豆根(2010158)、赤芍(2112073)、甘草(2112171)、蒲公英(2111031)、知母(2110073)、黄芩(2112083)、雪白睡莲(2106051)、黄连(2110039)、荆芥(2111100)、薄荷(2110083)、射干(2109143)、连翘(2111051)、黄药子(2010136)、苦楝皮、白芷(2109133)、黄柏(2111074)、栀子(2108054)、天花粉(2108021)、桔梗(2108049)、金银花(2110129)、黄芪(2202012)、防风(2201113)、地丁(2107029)、白蔹(2012198)27味中药均购自新疆乌鲁木齐尚德堂大药房；药敏片(20100290)购自杭州滨河微生物试剂有限公司；氨苄西林钠(H23020927)购自哈药集团制药总厂。

1.1.4 主要试剂及仪器 琼脂粉、THB培养基均购自青岛海博生物技术有限公司。麦氏比浊管购自珠海贝索生物技术有限公司；恒温水浴锅(HH-W420)购自上海亚荣生化仪器厂；旋转蒸发仪(RE-52)购自上海亚荣生化仪器厂；超净工作台(SW-CJ-2FD)购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂；恒温振荡器(THZ-C)购自上海天呈实验仪器制造有限公司；生化培养箱(DHP-9082D)购自北京市永光明医疗仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 中药水提物的制备 27味药材均采用如下方法处理：称取40 g药材，粉碎后按1∶15料液比加入蒸馏水，室温浸泡2 h，95 ℃回流提取2 h，倒出提取液，再按1∶10料液比加入蒸馏水95 ℃回流提取2 h；合并2次提取液，4 000 r/min离心10 min，抽滤，浓缩药液至4 g/mL，冷却后置4 ℃保存备用。

1.2.2 菌液的制备 将保存的纯化马链球菌马亚种接种于THB液体培养基中，37 ℃恒温振荡培养18～24 h，根据后续不同试验需要依据麦氏比浊法配制成相应所需浓度，4 ℃保存备用。

1.2.3 细菌敏感的单味中药筛选 采用牛津杯法[22]进行筛选。吸取100 μL培养至对数期、浓度为1×106CFU/mL的菌液加入TSA培养基表面，用玻璃涂布棒涂布均匀。定点放置牛津杯6个，将27味浓度为1 g/mL的中药水提物分别取200 μL加入牛津杯中，27味药均设3个平行。以青霉素、环丙沙星药敏片作为阳性对照，生理盐水作为阴性对照。37 ℃培养18～24 h，测量抑菌圈直径(R)，R≥15 mm为极敏；10 mm≤R<15 mm为高敏；8 mm≤R<10 mm为低敏；R<8 mm为不敏感[22]。

1.2.4 敏感单味中药最小抑菌浓度(MIC)及最小杀菌浓度(MBC)测定 采用美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的微量肉汤稀释法[23]，将培养至对数期的菌液，校准浓度至1×106CFU/mL。取100 μL浓度为1 g/mL的敏感单味中药水提物，在96孔板中用THB液体培养基以2倍稀释法至药液终浓度为0.001 g/mL，每孔中加入稀释好的菌液10 μL。只加菌液作为阳性对照，加药不加菌作为阴性对照，37 ℃培养18～24 h。在培养完成后，向其中加入5 g/L氯化三苯四氮唑(TTC)[22]。当孔内不显示红色时，细菌生长的最低药物浓度为MIC。将所有无菌生长的孔内液体以涂布法接种于THB琼脂平板上，37 ℃培养18～24 h，以菌落不超过5个为该单药的MBC。

1.2.5 敏感单味中药联合药敏(FIC)指数测定 采用微量棋盘稀释法[24]，将单味敏感药物两两组合，用无菌96孔板延X轴方向1～7行每孔依次加入THB肉汤、1/16 MIC、1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC、2 MIC的甲药水提物各50 μL，延Y轴A-G列每孔依次加入2 MIC、MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC的乙药水提物和THB肉汤各50 μL，每孔加入稀释好的菌液100 μL，混匀后盖上板，37 ℃培养18～24 h，培养完成后加入氯化三苯四氮唑(TTC)观察细菌生长情况，计算FIC指数。FIC指数=MIC甲药联合/MIC甲药单用+MIC乙药联合/MIC乙药单用[25]。所有试验均重复3次，每次进行质控菌株的检测。判断标准：FIC指数≤0.5时两药为协同作用，0.52.0时两药为颉颃作用[22]。

1.2.6 抗马链球菌马亚种基础组方药物主次作用测定 根据各单味药物之间的FIC结果，将筛选出的6味药物设置加药和不加药2个水平，分别用1和2表示，再按照L8(26)正交设计配制相应的8种组方溶液(分别为试验1、2、3、4、5、6、7、8组)，采用牛津杯法，测量8种组方溶液对马链球菌马亚种的抑菌圈直径。试验结果采用极差分析法统计,初步筛选出能够抑制马链球菌马亚种的优选因素。

1.2.7 抗马链球菌马亚种基础组方剂量优化试验 根据1.2.6的试验结果，对优选出的6个因素设计3个水平(1、0.5、0.25 g/mL)，分别用1、2和3表示，再按照L18(36)正交设计，配制18种组方溶液(分别为试验1～18组)，测量每组抑菌圈直径，每组平行测定3次，筛选出能够抑制马链球菌马亚种的最佳剂量组合，即得到基础组方的最优配比。

1.2.8 抗马链球菌马亚种加味组方体内抑菌试验 根据中兽医方剂配伍理论，将基础组方中的6味单药按优选浓度分别与不同配比、浓度的补虚药(黄芪、当归)等体积混匀，分为8组(表1)。将80只昆明小鼠随机分为8组，每组10只，每组每天均按照0.01 mL/g体重的药量灌胃1次，连续给药5 d，阴性对照组灌服等体积的生理盐水，阳性对照组灌服等体积2 mg/mL氨苄西林钠[26]。第5天灌胃1 h后，除空白对照组不做处理外，其余各组小鼠均腹腔注射0.5 mL浓度为0.8×109CFU/mL即80%最小致死量(MLD)[27-30]的马链菌液，进行马腺疫小鼠模型的构建。攻毒后通过观察小鼠临床症状，以肺脏出现充血及炎性细胞浸润的病理变化作为模型建立的判定标准[29-30]。再按上述给药方法连续灌胃2 d，其中空白对照组不作处理。在给药第7天，计算每组小鼠存活数、死亡数，根据公式计算保护率[31]。保护率(%)=(阴性对照组死亡数―处理(给药)组死亡数)/阴性对照死亡数×100%。同时将每组未死亡小鼠脱颈处死，采集肺脏组织，于4%多聚甲醛中固定后进行切片染色，观察病理组织学变化。

表1 小鼠体内抑菌试验分组及给药情况Table 1 Grouping and administration of in vivo antibacterial test in mice

2 结 果

2.1 马链球菌马亚种的敏感中药筛选结果

通过牛津杯法测定27味中药水提物对马链球菌马亚种抑菌效果如表2所示。由表2可知，马链球菌马亚种对浙贝母、大黄、苦参、山豆根、赤芍、甘草、蒲公英、知母极度敏感；对黄芩、雪白睡莲、黄连、荆芥、薄荷、射干、连翘、黄药子、苦楝皮、白芷、黄柏高度敏感；栀子、天花粉、桔梗、金银花、黄芪、防风、地丁、白蔹对其无抑菌作用，最终选择浙贝母、大黄、苦参、山豆根、赤芍、甘草、雪白睡莲开展后续试验。

表2 不同中药对马链球菌马亚种的抑菌圈直径Table 2 Diameter of inhibition zone of different herbs against Streptococcus equi subspecies equimm

2.2 敏感单味中药MIC及MBC测定结果

通过微量肉汤稀释法测定各敏感单味中药的MIC及MBC，结果见表3。由表3可知，大黄和雪白睡莲的MIC最小，均为0.078 g/mL，提示其抑菌作用最强，其次是山豆根、甘草、苦参，最后为浙贝母、赤芍。雪白睡莲的MBC最小，为0.078 g/mL，其次是赤芍和山豆根，然后为甘草、大黄、苦参和浙贝母。

表3 敏感单味中药MIC及MBC测定结果Table 3 Determination of MIC and MBC of single sensitive herbs g/mL

2.3 敏感单味中药FIC测定结果

由联合药敏指数公式计算得出各敏感中药间的FIC指数，发现浙贝母和雪白睡莲的FIC指数>2.00，提示二者有颉颃作用，根据试验结果综合考虑删减浙贝母，用剩余6味单药开展后续试验。

表4 敏感单味中药FIC测定结果Table 4 Determination of FIC of single sensitive herbs

2.4 抗马链球菌马亚种基础组方单味中药主次作用结果

极差法分析结果表明，在基础组方中各因素抗马链球菌马亚种的作用主次顺序为：苦参>大黄>雪白睡莲>甘草>赤芍、山豆根，即组方中抑制马链球菌马亚种效果最佳的是苦参，其次是大黄、雪白睡莲、甘草，最后是赤芍、山豆根(表5)。

表5 敏感药物对马链球菌马亚种的抑菌效果主次作用分析Table 5 Primary and secondary effect analysis of antibacterial effect of sensitive drugs against Streptococcus equi subspecies equi

续表

2.5 抗马链球菌马亚种基础组方剂量优化结果

采用极差分析法对结果进行分析，得出基础组方最佳配比组合为赤芍∶甘草∶大黄∶雪白睡莲∶山豆根∶苦参=4∶2∶2∶4∶4∶1。

表6 优选因素各组合对马链球菌马亚种抑菌作用结果Table 6 Bacteriostasis results for each combination of preferred factors against Streptococcus equi subspecies equi

2.6 抗马链球菌马亚种加味组方配比优化试验结果

2.6.1 抗马链球菌马亚种加味组方体内抑菌试验结果 由表7可知，与模型组相比，各药物组小鼠体内抑菌试验保护率明显增加，其中加味组方Ⅱ组(87.5%)=阳性对照组(87.5%)>加味组方Ⅲ组(62.5%)>加味组方Ⅰ组(37.5%)>加味组方Ⅳ组(25%)>基础组方组(25%)，由此可知加味组方Ⅱ组为抗马链球菌马亚种最优组合。

表7 加味组方体内抑菌保护率Table 7 In vivo antibacterial protection rate of modified formula

2.6.2 各组小鼠肺脏病理组织学变化结果 由图1可知，空白对照组肺脏结构完整，肺泡无充血和炎性细胞，肺泡腔无渗出(图1A)；加味组方Ⅰ组在第7天灌胃结束后，肺脏结构完整，但肺泡腔中有大量渗出物(图1B)；加味组方Ⅱ组在第7天灌胃结束后，肺脏结构完整，染色均匀，修复良好(图1C)；加味组方Ⅲ组在第7天灌胃结束后，肺泡壁依旧有严重的充血及炎性细胞浸润(图1D)；加味组方Ⅳ组、基础组方组在第7天灌胃结束后，肺泡壁依旧有少量炎性细胞浸润(图1E、1F)；阴性对照组在第7天灌胃结束后，肺泡壁充血且有炎性细胞浸润，肺泡腔中有浆液性渗出混有少量的红细胞及脱落的上皮细胞(图1G)；阳性对照组在第7天灌胃结束后，肺泡壁毛细血管扩张充血，有炎性细胞浸润，肺泡腔体积缩小(图1H)。

①A～H，分别代表空白对照组、加味组方Ⅰ组、加味组方Ⅱ组、加味组方Ⅲ组、加味组方Ⅳ组、基础组方、阴性对照组、阳性对照组。②a，脱落的上皮细胞和浆液性分泌物；b，炎性细胞浸润；c，恢复正常的肺泡；d、e，严重充血和炎性细胞浸润 ①A-H,Blank control group,modified formula group Ⅰ,modified formula group Ⅱ,modified formula group Ⅲ,modified formula group Ⅳ,basic formula,negative control group and positive control group,respectively.②a,Sloughed epithelial cells and serous secretions;b,Inflammatory cell infiltrates;c,Normal alveoli;d and e,Severe hyperemia and inflammatory cell infiltration图1 各组肺脏病理切片观察(HE染色，100×)Fig.1 Observation of lung pathological sections of each group (HE staining,100×)

3 讨 论

目前研究结果表明，在中国的新疆北部地区、加拿大、埃及均出现了马链球菌马亚种对β内酰胺类、万古霉素普遍耐药的现象[32-36]，寻找一种替代疗法迫在眉睫。中药来源于植物、动物或矿物，耐药性低、毒性低以及副作用小，现已成为研究的热点。基于此，本试验根据马腺疫治疗原则以及“十八反、十九畏”[11,37-38]选取了27味中药，首先开展了体外抑菌试验，结果显示马链球菌马亚种对浙贝母、大黄、苦参、山豆根、赤芍、甘草、蒲公英、知母极度敏感，结果与王雨朦[30]结果相似，其中蒲公英和知母清热解毒的药性与前几种中药有重合，所以将其剔除。刘丹丹等[39]研究发现，雪白睡莲对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌等常见菌种展现出的极强的广谱抗菌作用，且其作为新疆地道药材其质量优、产量高，因此纳入敏感单药中。MIC和MBC的测定结果显示，大黄和雪白睡莲的MIC最小，为0.078 g/mL，提示其抑菌作用最强，雪白睡莲的MBC最小，为0.078 g/mL，该结果与牛津杯法结果并不完全符合，怀疑是不同试验中药物与细菌共培养的状态不同而影响了药物的抑菌效果。单一中药通常只有1～2种药理作用，当联合使用多种中药时，可能会发生协同效应并全面展现相关的药理作用，因此试验近一步对筛选出的敏感单味药物组方。为避免直接按抑菌效果组方的盲目性，借助联合药敏试验和正交试验[40]，以剔除相颉颃药物，消除各因素间干扰。联合药敏试验结果显示，浙贝母和雪白睡莲FIC指数>2，提示二者颉颃，但因雪白睡莲和其他药物的协同相加作用更强，综合考虑删减浙贝母。通过正交试验，得出抗马链球菌马亚种的基础组方最佳配比为赤芍∶甘草∶大黄∶雪白睡莲∶山豆根∶苦参=4∶2∶2∶4∶4∶1。

传统中兽药组方中除针对治则选取药物外，还会相应添加补虚药，研究发现补虚药具有良好的免疫增强功能，有些可以刺激机体的免疫应答系统[41]，常见补虚药物有黄芪、当归、人参、白术等。在基础组方前提下，添加黄芪与当归2味补益药物。根据相关文献记载，黄芪当归在5∶1配伍时，促血管新生疗效最佳，黄芪当归在1∶1配伍时，能提高骨髓造血机能[42-44]。结合本研究体内抑菌试验结果可知，在黄芪当归以1∶1配伍，浓度为0.5 g/mL加味时，治疗马腺疫小鼠模型的效果最佳，保护率可达87.5%，与阳性对照组(氨苄西林钠)相当。氨苄西林钠属于青霉素类抗生素，主要用以治疗敏感细菌所致的上、下呼吸道感染、胃肠道感染等，在本试验中虽然其显著降低了小鼠的死亡率，但肺脏病理切片结果显示，对于马链球菌马亚种引起的肺脏炎性损伤，修复作用较差。而在组方治疗下，小鼠肺脏的病理变化明显减轻，表明组方不但可以降低小鼠的死亡率，并且对马链球菌马亚种所致小鼠肺脏的炎性损伤有一定的改善作用。虽然建立马腺疫小鼠模型，可以显著降低试验成本，由于组方成分复杂，进入机体内后会受到温度、pH、作用部位及宿主健康状况等多种因素影响[45]，组方对于小鼠模型的治疗效果是否与本体动物治疗效果相当还有待近一步研究。

4 结 论

本研究通过单味中药体外抑菌试验(牛津杯法)、联合药敏试验和正交试验成功筛选出了一种抗马链球菌马亚种的中药组方，配比为赤芍∶甘草∶大黄∶雪白睡莲∶山豆根∶苦参∶黄芪当归(1∶1)=4∶2∶2∶4∶4∶1∶1；中药组方体内抑菌保护率可达87.5%，同时该组方对马链所致肺脏炎性损伤有改善作用，在马腺疫无特效药的情况下，可为临床用药提供一定的技术支持。