静原鸡let-7a-5p的靶基因预测及组织表达分析

邓占钊，禹保军，曹国伟，张 娟，石永宏，胡伟龙，仇秀玲

(1.彭阳县畜牧技术推广服务中心，固原 756599；2.宁夏大学农学院，银川 750021；3.宁夏九三零生态农牧有限公司，银川 750021)

随着家禽育种工作对生长速度的高强度选择，快大型育肥鸡生长至42日龄时体重可达2.5 kg以上[1]。尽管肉鸡具有较高的生长速度和产肉性能，但其肉品质量却显著下降，尤其肉品风味下降较快[2]。因此，在禽类生长速度提高的前提下，改善肉质风味，培育肉质优良、风味独特的优质地方鸡种成为现代畜禽分子育种的主要研究方向。在各种肉类产品中，鸡肉因其高蛋白、低脂肪和低胆固醇的特性成为当前消费者营养补给的重要食品。静原鸡作为优良的地方鸡种，个体小、生长速度慢，肌肉内肌苷酸(IMP)含量高[3]，是肌肉品质研究的理想动物模型。

microRNA(miRNA)是一类小的单链内源性非编码RNA，长度为17～24 nt[4]。miRNA主要通过介导RNA诱导沉默复合体(RISC)结合靶基因从而调节基因的表达及稳定性[5]，其作为一种在物种间高度保守的短链非编码RNA，主要通过翻译抑制或使mRNA降解来调节基因表达[6]。当前关于miRNA对肉品质的调控研究主要集中在其对骨骼肌发育调控[7]、肉质形成[8]、不同肌肉类型形成[9-11]、不同体组织形成[12]、不同处理后影响[13]等方面。研究证实，let-7a在动物生长发育、细胞分化与凋亡等方面发挥着重要的调控作用[14-16]。实验室前期通过转录组测序发现，let-7a-5p在静原鸡胸肌和腿肌组织中高度表达，且在胸肌中表达水平显著高于腿肌[17]，推测let-7a-5p可能参与调节静原鸡肌肉发育及肉品质。鉴于此，本试验通过成熟序列比对、靶基因功能注释及静原鸡各组织表达谱分析，探讨let-7a-5p在静原鸡肌肉组织中的功能作用，以期为进一步探究let-7a-5p的功能和作用机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

采集180日龄静原鸡公鸡和母鸡的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸肌和腿肌组织，用手术剪快速分离成黄豆大小，放入冻存管投入到液氮罐中，带回实验室于―80 ℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 let-7a-5p序列比对及保守性分析 从已验证的miRNA-Seq结果中筛选出差异表达的let-7a-5p，其测序获得的成熟序列为：5′-UGAGGUAG-UAGGUUGUAUAGUU-3′。在miRbase(http:∥www.mirbase.org/)数据库中下载人(Homosapiens，hsa)、小鼠(Musmusculus，mmu)、大鼠(Rattusnorvegicus，rno)、猕猴(Macacamulatta，mml)、牛(Bostaurus，bta)、原鸡(Gallusgallus，gga)、鳕鱼(Gadusmorhua，gmo)和山羊(Caprahircus，chi)的let-7a-5p成熟序列(表1)。利用Mega 7.0软件将miRNA-Seq中获得的let-7a-5p的成熟序列与上述8个物种进行比对，分析其物种间保守性。

1.2.2 let-7a-5p靶基因预测 将let-7a-5p信息提交在线软件miRanda (https:∥www.miranda.org/)、TargetScan (http:∥www.targetscan.org/)和miRDB (http:∥mirdb.org/miRDB/)预测靶基因，三者交集组成的基因集合可进行后续分析。

1.2.3 let-7a-5p靶基因功能富集分析 使用在线数据库DAVID(https:∥david.ncifcrf.gov/)对靶基因集合进行GO功能和KEGG通路富集分析，以P<0.05为阈值定义靶基因显著富集的GO条目和KEGG通路。

1.2.4 let-7a-5p与靶基因互作网络分析 利用Cytoscape软件绘制let-7a-5p与靶基因的调控网络。

1.2.5 组织表达分析 使用RNAiso Plus试剂(Code No.D9108A)提取静原鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸肌和腿肌组织总RNA，按照反转录试剂盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real-time)(TaRaKa公司)说明书反转录为cDNA，―20 ℃保存备用。采用茎环法设计let-7a-5p的反转录引物(RT)和特异性定量引物，以U6为内参，引物序列见表2。使用QuantiNovaTMSYBR®Green PCR试剂盒(QIAGEN公司)在CFX系统中进行实时荧光定量PCR检测。PCR反应体系10 μL：SYBR Green 5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL。PCR反应程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，共39个循环；熔解曲线分析：60～95 ℃ 4 s。每个样本3个重复。

表2 引物信息Table 2 Primer information

1.2.6 数据处理 利用2―ΔΔCt计算各个样品的基因相对表达量，使用单因素方差分析(One-Way ANOVA)对数据进行分析，结果以平均值±标准误表示，P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 物种间保守性

将鸡let-7a-5p成熟序列与人、小鼠、大鼠、猕猴、牛、原鸡、鳕鱼和山羊进行比对，发现其与8个物种let-7a-5p的成熟序列完全一致，长度均为22 nt，表现出高度的物种保守性。

2.2 let-7a-5p靶基因预测

利用在线软件miRDB、TargetScan、miRanda预测得到let-7a-5p的靶基因分别为562、365和283个，三者交集共获得38个基因集合(图1)。

图1 let-7a-5p的靶基因预测结果Fig.1 Predicted results of let-7a-5p target genes

2.3 let-7a-5p靶基因GO功能注释分析

对38个let-7a-5p靶基因集合注释分析发现，在生物过程中，靶基因富集较多的前4个GO条目分别是细胞过程(cellular process)、代谢过程(metabolic process)、生物调节(biological regulation)和生物过程调节(regulation of biological process)；在细胞成分中，靶基因在细胞(cell)和细胞部分(cell part)富集最多，其次在细胞器(organelle)和细胞器部分(organelle part)富集较多；在分子功能中，靶基因富集最多的GO条目是结合(binding)，其次在催化活性(catalytic activity)条目也富集较多(图2)。

图2 let-7a-5p靶基因的GO功能富集条目Fig.2 GO function enrichment terms of let-7a-5p target genes

2.4 let-7a-5p靶基因KEGG通路富集分析

通过KEGG通路富集分析发现，let-7a-5p的38个靶基因在聚酮糖单元生物合成(polyketide sugar unit biosynthesis)、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、泛素介导的蛋白水解(ubiquitin mediated proteolysis)、TGF-β信号通路(TGF-beta signaling pathway)和加压素调节的水重吸收(vasopressin-regulated water reabsorption)显著富集。前20个通路中富集最多的是代谢途径(metabolic pathways)、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、泛素介导的蛋白水解和MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)(图3)。

图3 let-7a-5p靶基因KEGG通路富集分析Fig.3 KEGG pathway enrichment analysis of let-7a-5p target genes

2.5 let-7a-5p靶基因互作分析

miRNA主要作用于mRNA的3′-UTR，通过抑制或降解靶基因发挥调控作用。在miRNA-靶基因调节网络中，一个miRNA可以靶向调节多个mRNA的表达。本研究中，let-7a-5p通过靶向抑制基因表达，从而在生物过程中扮演重要角色(图4)。

图4 let-7a-5p与靶基因调控网络Fig.4 let-7a-5p and target gene regulatory network

2.6 静原鸡let-7a-5p的组织表达

由图5可知，let-7a-5p在静原鸡公、母鸡的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸肌和腿肌组织中均有表达，且在胸肌和腿肌中表达量均较高，其中，在母鸡的心脏和腿肌中高表达，与其他几个组织间存在显著差异(P<0.05)；除了在公鸡的肝脏中表达量较低外，其他组织中表达量相对较高，且肝脏与肺脏间存在显著差异(P<0.05)。

①A，母鸡；B，公鸡。②数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)；肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05) ①A，Female;B,Male.②Values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05)；While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05)图5 静原鸡let-7a-5p的组织表达分析Fig.5 Tissue expression analysis of let-7a-5p in Jingyuan chickens

3 讨 论

随着分子生物学的快速发展，miRNA功能在不同物种中的研究日益增多。在猪的肌肉形成和肉质调控方面[18-19]，miR-1、miR-133、miR-206被证实在肌细胞形成过程中发挥了重要调控作用[20]，其中miR-1和miR-133主要在骨骼肌的形成过程中发挥作用，而miR-206主要通过调控组蛋白脱乙酰酶4(HDAC4)的表达来调控成肌细胞的分化过程[21]。在快大型白羽肉鸡与杏花鸡的研究中发现，生长激素受体(GHR)基因是差异表达基因miR-146b-3p作用的靶点，且miR-34c、miR-223、miR-146b-3p、miR-21和miR-205a在肌肉生长调控中发挥着重要作用[22]。大量研究表明，位于细胞质的一些lncRNAs可与miRNA结合而在动物生长、肌肉发育[23]及脂肪的形成和代谢[24]过程中发挥重要的调控作用。lnc-MD1可与MAML1和MEF2C竞争性结合miR-133和miR-155，从而提高这2个基因的表达水平，在肌肉分化中发挥作用[23]。但目前有关miRNA在静原鸡肌肉生长发育及肉品质上的相关研究甚少。

miRNA的表达具有明显的种属、组织特异性及时空特征，明确miRNA在特定发育阶段不同组织器官中的表达水平，对研究miRNA在这些组织器官和发育阶段的生物学过程中所起的作用具有重要意义。let-7家族是miRNA中研究最深入的小RNA，参与发育时序性调节[25]。研究发现，let-7a在肿瘤细胞的增殖[26-31]、分化[32-33]、脂肪生成及药物敏感性[34]等方面发挥着重要调控作用，过表达let-7a可以抑制肺癌在裸鼠中的转移[35]。因此，let-7a在机体多种生物学过程中具有重要的调控功能。本研究使用生物信息学软件预测let-7a-5p的靶基因，根据miRDB、TargetScan和miRanda的不同算法预测得到靶基因数分别为562、365和283个，为了提高靶向关系的准确性，取3个软件预测的交集作为下一步分析的基因集合，共有38个靶基因集合在细胞过程、代谢过程和生物调节等生物过程，细胞和细胞部分等细胞成分，以及结合和催化活性等分子功能中。let-7a-5p预测的靶基因显著富集于聚酮糖单元生物合成、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、泛素介导的蛋白水解、TGF-β信号通路和加压素调节的水重吸收通路中。TGF-β是一类多功能的分泌蛋白，属于转化生长因子超家族，包含3种亚型：TGF-β1、TGF-β2以及TGF-β3。在成肌细胞状态转换过程中，TGF-β的3种亚型均可以促进成肌细胞的增殖，通过促进MyoD降解和抑制MyoG的表达来抑制成肌细胞的分化[36]。因此，推测let-7a-5p通过TGF-β信号通路作用于靶基因的表达，进而参与调节静原鸡成肌细胞的增殖与分化。

本研究中，let-7a-5p在静原鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸肌和腿肌组织中均有表达，且在公、母鸡的胸肌和腿肌中表达量均较高，表明let-7a-5p可能调控静原鸡肌肉的生长发育，但仍有待于进一步研究。

4 结 论

let-7a-5p的成熟序列在多个物种间高度保守，其38个靶基因集合显著富集于聚酮糖单元生物合成、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、泛素介导的蛋白水解、TGF-β信号通路和加压素调节的水重吸收等信号通路。let-7a-5p下游可能通过调节多个潜在靶基因的表达，进而调控静原鸡成肌细胞的增殖与分化。let-7a-5p在静原鸡胸肌和腿肌中表达量较高，说明其在静原鸡肌肉组织生长发育中扮演着重要角色。