响应面法优化含活性肽CC34毕赤酵母重组菌冻干营养保护剂的研究

李 爽，杜家华，白志辉，曲 可，苏 苗，姜 宁，张爱忠

(黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江省寒区饲料资源高效利用与营养调控重点实验室，农业农村部东北平原农业绿色低碳重点实验室，大庆 163319)

肽是2个或2个以上的氨基酸以肽键相连构成的化合物，在动物机体内可以发挥重要的生理功能。具有生物活性的多肽称为活性肽，又称生物活性肽，其种类繁多，其中宿主防御肽就是一种可以通过诱导生物体发生免疫反应而产生的小分子多肽[1]。活性肽的生物学功能十分多样，具有能抵抗多种细菌、不产生耐药性等优势[2]，在机体的生长、发育、免疫调节和新陈代谢中发挥着重要作用。将活性肽转化到毕赤酵母表达系统中可以提高活性肽在重组菌中的表达量[3]。为了保证菌种的质量，保持菌种的活力，选用正确的菌种保存方法和技术十分重要，而冻干菌粉便于长期储存和使用，在实践和研究中取得了理想的效果[4-5]。冷冻干燥技术一直是生产干燥细菌粉末的经典方法，也被证明是保存细菌最方便和成功的方法，然而干燥过程是在低温下进行的，细菌菌体可能会受到不可逆转的损害[6]，而且并非所有菌株都能存活或保留功能活性，如生物防治活性、冷冻干燥后的酶活性和酸化活性[7]。在冷冻干燥的低温环境下，由于细胞内盐浓度增加，胞内的水分会随之向胞外渗透，渗透出的水遇冷形成冰晶，这种渗透休克是细胞活力丧失的主要原因[8]。低温保护剂能将微生物固定在具有高黏度和低流动性反应的材料中，可防止细胞活力丧失。在低温保护剂成分中，蔗糖、乳糖、海藻糖、葡萄糖、山梨醇、谷氨酸钠、抗坏血酸和脱脂乳粉是冻干酵母和毕赤酵母属最常用的保护剂[9]。Abadias等[10]研究表明，添加10%脱脂乳粉对念珠菌CPA-1有较好的冻干保护效果。张菊等[11]用复合保护剂(含脱脂乳粉20%、海藻糖10%、甘油2%和低聚木糖5%)保护植物乳杆菌，可使其冻干存活率达到80%以上。陈合等[12]研究发现，添加0.6%的山梨醇可以使双歧杆菌冻干存活率达到77%。但冻干保护剂的保护效果因微生物菌株而异，目前鲜见有关基因重组毕赤酵母菌冻干保护剂的研究。本实验室前期获得了含活性肽CC34的毕赤酵母菌重组菌[13]，为了能使其更好地应用到生产实践中，本研究拟通过单因素筛选结合响应面分析法优化冻干毕赤酵母重组菌保护剂配方，使其具备高稳定性和高活力，以期为含活性肽CC34毕赤酵母重组菌商业化生产提供保障。

1 材料与方法

1.1 材料

含活性肽CC34毕赤酵母重组菌：将活性肽CC34利用电转方法转入毕赤酵母菌SMD1168中，由黑龙江八一农垦大学动物营养实验室提供；脱脂乳粉、海藻糖、山梨醇、谷氨酸钠均购自北京博奥拓科技有限公司；YPD基础培养基：蛋白胨2%，酵母浸出粉1%，葡萄糖2%；YPD固体培养基：在液体培养基基础上加入2%的琼脂粉即可，YPD液体及固体培养基115 ℃灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 毕赤酵母重组菌活化 将置于-80 ℃的甘油保菌管取出，解冻。用接种环沾取菌液后在YPD固体培养基上平板划线，于30 ℃恒温培养箱中培养16～18 h。用接种环挑取单菌落接种到YPD液体培养基中，在30 ℃条件下220 r/min摇床培养。

1.2.2 毕赤酵母重组菌的冻干及复水 毕赤酵母重组菌30 ℃条件下220 r/min摇床培养18 h，4 ℃、4 000 r/min离心20 min，弃掉上清液收集菌泥。按照菌泥∶保护剂=1∶2比例加入冻干保护剂，取1 mL分装至西林瓶后用胶塞密封处理，于-20 ℃预冻3 h后放入真空冷冻干燥机(冷冻温度为-56 ℃、真空度为1 Pa)冻干24 h。冻干成粉后加入YPD液体培养基至冻干前体积。

1.2.3 单一保护剂的筛选 将4种单一保护剂加入无菌水配制到所需浓度(W/V)，具体为：脱脂乳粉浓度1%、5%、10%、15%、20%，海藻糖浓度5%、10%、15%、20%、25%，山梨醇浓度5%、10%、15%、20%、25%，谷氨酸钠浓度1%、2%、3%、4%、5%，于115 ℃灭菌15 min。按照1.2.2的方法制备冻干菌粉，通过活菌计数法考察单一保护剂在不同浓度下的保护效果。根据单因素试验保护效果排序，选择效果较好的前3种冻干保护剂为最优单因素进行下一步的复配试验。

1.2.4 响应面法优化毕赤酵母重组菌冻干保护剂配比 根据单因素试验结果，从4种单一保护剂中选择保护效果较好的3种：脱脂乳粉、海藻糖和山梨醇，分别设定为变量A、B、C，毕赤酵母重组菌的冻干存活率为响应值(Y)，采用Design-Expert 12软件设计17组试验，12组为析因点试验，5组为重复零点试验，因素水平见表1。

表1 试验各因素水平表Table 1 Test factors and levels %

1.3 测定指标

活菌计数采用YPD液体培养基复水至原体积；菌种计数采用梯度稀释平板法；菌体存活率计算公式为：

酵母存活率(%)=(冷冻干燥后每毫升菌液活菌数/冷冻干燥前每毫升菌液活菌数)×100%

1.4 数据分析

采用Design-Expert 12.0软件进行响应面的设计、数据的分析和回归模型的建立；采用SPSS 23.0软件对单因素试验数据采用One-Way ANOVA、Tukey’s 检验进行方差分析和多重比较，每组试验重复3次，每次2个平行样，试验结果以平均值±标准差表示。P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 单因素试验结果

2.1.1 脱脂乳粉对毕赤酵母重组菌冻干存活率的影响 由图1A可知，与空白组相比，添加不同浓度的脱脂乳粉对毕赤酵母重组菌冻干存活率均有显著提高(P<0.05)。在0～10%范围内，菌体冻干存活率随脱脂乳粉浓度的增加而提高，当脱脂乳粉浓度达到10%时冻干存活率最大，为51.23%。但当脱脂乳粉浓度超过10%时，冻干存活率随脱脂乳粉浓度的增加反而下降。

2.1.2 海藻糖对毕赤酵母重组菌冻干存活率的影响 由图1B可知，与空白对照组相比，添加海藻糖对提高毕赤酵母重组菌冻干存活率均起到了显著的效果(P<0.05)，海藻糖浓度为10%、15%、20%时保护效果较好。当海藻糖浓度增加到15%时冻干存活率最大，为67.50%，但当海藻糖浓度超过15%时，毕赤酵母重组菌的存活率呈现逐步下降趋势。

2.1.3 山梨醇对毕赤酵母重组菌冻干存活率的影响 由图1C可知，山梨醇浓度在0～20%的范围内，随着山梨醇浓度的增加，毕赤酵母重组菌冻干存活率逐渐提高，当山梨醇浓度为20%时，毕赤酵母重组菌冻干存活率最高，为52.19%，显著高于其他浓度条件下的冻干存活率(P<0.05)。

2.1.4 谷氨酸钠对毕赤酵母重组菌冻干存活率的影响 由图1D可知,当谷氨酸钠添加量为1%时，冻干保护效果与空白组没有显著差异(P>0.05)；当添加量为3%时，毕赤酵母重组菌冻干存活率最大，为36.92%，显著高于其他各组(P<0.05)。

添加以上4种冻干保护剂均起到了较好的保护效果，保护剂保护效果排序为海藻糖>山梨醇>脱脂乳粉>谷氨酸钠。选择前3种冻干保护剂为最优单因素，进行下一步的复配方案。

2.2 Box-Behnken响应面优化复合冻干保护剂配比

以3种保护剂进行响应面设计，共17组，12组为析因点试验，5组为重复零点试验，分别测定毕赤酵母重组菌冻干存活率，结果见表2。采用Design Expert 12.0软件对表2数据进行二次回归方程拟合，得到菌体存活率(Y)对脱脂乳粉(A)、海藻糖(B)、山梨醇(C)的二次多项回归方程：Y=76.20+6.57A+4.18B+0.60C-1.83AB-1.19AC+2.94BC-20.94A2-14.23B2-11.37C2。

①A、B、C和D分别为脱脂乳粉、海藻糖、山梨醇和谷氨酸钠的效应。②肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)；肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05) ①A,B,C and D indicated the effects of skim milk powder,trehalose,sorbitol and sodium glutamate,respectively. ②Values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05);While with the same letter superscripts mean no significant differences图1 不同冻干保护剂对毕赤酵母重组菌存活率的影响Fig.1 Effects of different freeze-drying protectants on the survival rate of recombinant Pichia pastoris

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface experiment

续表

表3 响应面试验方差分析表Table 3 Variance analysis of regression model

通过软件Design-Expert 12.0绘制脱脂乳粉、海藻糖、山梨醇对毕赤酵母重组菌体存活率的交互作用和响应面分析图(图2)。由图2可知，3个响应面均具有极值点，都为开口向下的凸形球面。根据响应面建立的数学模型分析，最佳的冻干保护剂配方为：脱脂乳粉浓度为10.75%、海藻糖浓度为15.70%、山梨醇浓度为20.19%，在此条件下预测菌体存活率为77.00%。

图2 脱脂乳粉、海藻糖以及山梨醇交互作用等高线图及相应响应面图Fig.2 Contour maps and corresponding response surface maps of interaction of skim milk powder,trehalose and sorbitol

2.3 验证试验结果

将毕赤酵母重组菌按筛选出的最优配比进行3组重复试验，毕赤酵母重组菌平均存活率为(78.98±1.63)%。

3 讨 论

徐颖等[14]研究发现，随着脱脂乳粉浓度的增加，脱脂乳粉对富硒鼠李糖乳杆菌的保护效果也随之提高，达到饱和后，随着脱脂乳粉浓度的提高，菌体的存活率趋于稳定或些许下降。脱脂乳粉是一种常见的大分子胞外保护剂[15]，在冻干过程中脱脂乳粉可以在菌体表面自然形成保护层以防止菌体受到损害，而且脱脂乳粉当中还含有大量的蛋白和糖类对细胞起到固定作用，蛋白和糖类能减少细胞与介质的接触面积，增强细胞壁免遭损伤，避免细胞内的物质渗漏[16]。在本试验中，当脱脂乳粉浓度达到10%时冻干菌存活率最高，之后随浓度继续增加其保护效果反而降低，结合实际生产成本方面的考虑，脱脂乳粉浓度选择10%比较适宜。

海藻糖作为一种双糖，在菌体失水的情况下，海藻糖能够与菌体失水点通过氢键相连形成新的保护层，降低冰晶的形成损坏细胞膜，充分起到保护细胞膜结构的作用[17]。在蛋白质冷冻的过程中能填充到因蛋白质失水而形成的空缺中，从而有效地抑制微生物中的蛋白质在冷冻过程中发生的变性[18]。张瑶等[19]发现，当海藻糖作为单一保护剂且浓度为12%时，对植物乳杆菌V02保护效果最好。从本试验结果看，当海藻糖在15%时，对毕赤酵母重组菌起到了较好的保护效果。

对于不同的菌种，保护剂的保护能力不尽相同。山梨醇具有良好的保湿性能，可以与水分子结合，同时能够极易渗透进微生物的细胞内部[20]，进入细胞内的山梨醇使其内部的黏性更强，黏稠度高可抑制水形成冰晶，进而保护细胞不受损坏，还可以维持细胞的活性[21]。本试验结果表明，20%的山梨醇对毕赤酵母重组菌起到了显著的保护作用。

本试验通过单因素筛选试验初步确定了所选取的冻干保护剂的浓度范围，然后结合响应面分析得出3种保护剂(脱脂乳粉、海藻糖和山梨醇)的最优浓度。三者的相互结合使得菌体的存活率得到更稳固的保障。响应面曲面图直观反映各因素间的交互作用对响应值影响的显著程度，曲面图越陡表示交互作用越强，曲面图越平则表示交互作用越弱。本试验对响应面模型预测结果进行了验证，使用10.75%的脱脂乳粉、15.70%的海藻糖和20.19%的山梨醇作为活性肽CC34毕赤酵母重组菌的冻干保护剂，菌体存活率为78.98%，与响应面法的预测值77.00%接近，说明利用响应面法建立的数学模型可信度较高。

许多研究表明，单独使用一种保护剂通常不能很好地保护菌株在冷冻干燥过程中的稳定性。不同的冷冻参数也会对相同菌株产生不同的应力反应。因此，在选择保护剂时要考虑能否保持菌株稳定、保护剂能否起到保护作用、配方成本最低等。在实际应用中，可以选择多种保护剂以复配的方式来提高菌体冻干存活率。如糖类保护剂与蛋白质易产生氢键，但缓冲能力比较弱，这时可以用氨基酸类保护剂进行弥补[22]。因此，在冷冻干燥过程中选择最优配方和最佳冻干工艺，不仅能最大限度地提高菌株稳定性，还能控制保护剂成本。

4 结 论

毕赤酵母重组菌复合冻干保护剂配方为：脱脂乳粉浓度为10.75%，海藻糖浓度为15.70%，山梨醇浓度为20.19%。采用响应面法预测出的菌体冻干存活率为77.00%，通过验证试验获得的菌体冻干存活率达到78.98%。该复合冻干保护剂可用于对毕赤酵母重组菌的保存和后续试验的研究。