高效液相色谱法同时测定山茶油中 9种抗氧化剂

2022-10-20杨坤,吴凯仪,杨梅花等

现代食品 2022年17期

山茶油作为东方橄榄油，含有丰富的不饱和脂肪酸等营养成分，其在储存过程中易被氧化变质和酸败，导致其品质和营养价值降低，甚至引起食物中毒[1-2]。在山茶油中加入抗氧化剂可防止油脂氧化，提高山茶油的稳定性，延长山茶油的保质期[3]。山茶油中常加入的抗氧化剂主要有叔丁基对苯二酚（Tert-Butylhydroquinone，TBHQ）、叔丁基对羟基茴香醚（Butyl Hydroxyanisole，BHA）、2,6-二叔丁基对甲基苯酚（Butylated hydroxytoluene，BHT）和没食子酸丙酯（Propyl Gallate，PG）等人工合成的酚类抗氧化剂，具有一定的毒性，我国对其在油脂的使用量有明确的限量要求[4-5]。随着食品工业科技的发展，2,4,5-三羟基苯丁酮（2,4,5-trihydroxybutyrophenone，THBP）、去甲二氢愈创木酸（Nordihydroguaiaretic acid，NDGA）、2,6-二叔丁基-4-羟甲基苯酚（Ionox-100）、没食子酸辛酯（Octyl Gallate，OG）和没食子酸十二酯（Dodecyl Gallate，DG）等以抗氧化为目的的添加剂被越来越多地应用于植物油中[6-7]。

抗氧化剂常用的检测方法有液相色谱法[8-9]、气相色谱法[10]和液相色谱法串联质谱法[11]等，其中气相色谱法受化合物极性、沸点限制，液相色谱串联质谱法仪器设备昂贵、普及率低，且油样的基质效应较大，不容易定量，限制了该方法的应用。而液相色谱法在抗氧化剂上具有较高的灵敏度，且适用于NDGA、OG、DG等9种抗氧化剂的同时检测。本文通过结合采用凝胶色谱和液相色谱，建立一种简单快速、操作简便，能够同时测定山茶油中9种抗氧化剂含量的方法，为其他油脂样品的测定提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

42批次山茶油，市购。

TBHQ、BHA、BHT、PG、THBP、NDGA、Ionox-100、OG和DG等9种抗氧化剂标准溶液质量浓度均为1 000 μg·mL-1，坛墨质检；乙酸乙酯、环己烷、甲醇、甲酸均为色谱纯；实验室用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

GPC Cleanup 800凝胶色谱仪，北京莱伯泰科仪器有限公司；E2695型高效液相色谱仪，美国沃特世公司；RE-52旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；ML104型电子天平，梅特勒-托利多（上海）仪器公司；Milli-Q型纯水机，美国Millipore公司；KQ-700DE型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配制

准确吸取9种混合抗氧化剂标准溶液1.00 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈溶液定容至刻度，得100 mg·L-1的混合标准储备溶液，于4℃保存，备用。临用前用乙腈溶液稀释，配制成质量浓度为0.10 mg·L-1、0.25 mg·L-1、0.50 mg·L-1、1.00 mg·L-1、2.50 mg·L-1、5.00 mg·L-1、10.0 mg·L-1和 50.0 mg·L-1混合标准溶液。

1.3.2 样品处理方法

准确称取5.00 g（精确至0.01 g）山茶油样于50 mL容量瓶中，加入40 mL乙酸乙酯/环己烷（1∶1，V∶V）溶液，超声10 min，冷却至室温后定容至刻度，过0.45 μm有机滤膜。取5 mL样液于GPC净化系统，GPC流动相：乙酸乙酯/环己烷（1∶1，V∶V），流速为5.0 mL·min-1，检测波长为256 nm，样品收集时间为7.50～16.0 min。将收集液在40 ℃下旋转蒸发至近干，再用初始流动相定容至2.00 mL，待测。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Stable Bond AQ柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；进样量10 μL；柱温：35 ℃；流速：1.00 mL·min-1；检测波长：280 nm；流动相：A为甲醇，B为0.5%甲酸水溶液；洗脱程序：0～5.00 min，A55%；5.00～15.00 min，A 55%→35%；15.00～22.00 min，A 35%→20%；22.00～25.00 min，A20% → 10%；25.00～ 27.00 min，A 10% → 55%；27.00～35.00 min，A 55%。

2 结果与分析

2.1 GPC净化条件优化

山茶油主要成分为脂肪酸，含有部分色素、矿物质，凝胶色谱在净化油类样品时具有明显的优势[12-13]，为确定9种抗氧化剂在凝胶色谱净化系统的出峰时间，在1.3.2项下，以阴性样品和加标样品上GPC系统，其阴性样品GPC色谱图见图1（a），加标样品见图1（b）。由图1可知，山茶油脂肪等成分在8 min之前完全流出，9种抗氧化剂在8～16 min全部流出。因此，选择样品收集时间为8～16 min。

图1 9种抗氧化剂在GPC色谱图

2.2 色谱条件优化

9种抗氧化剂化合性质类似，选择乙腈作为有机相时，发现部分抗氧化剂峰重叠；而甲醇作为有机相能较好地分离9种抗氧化剂，因此本文选择甲醇作为有机相。本次实验发现在水相中加入一定量的甲酸能改善PG和THBP的峰拖尾，赵慧男等[7]也验证了在水相中加入一定比例的甲酸可以改善抗氧化剂的峰型。因此，本实验选择水相为0.5%甲酸水溶液。优化后的空白山茶油样品和加标山茶油样品（10 mg·kg-1）的色谱图见图2。

图2 9种抗氧化剂的色谱图

2.3 标准曲线、检出限与定量限

在仪器工作条件下对标准溶液系列进行测定，以质量浓度为横坐标，以其相对应的峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线。结果表明，9种抗氧化剂在各自质量范围内呈良好的线性关系，相关系数均＞0.999；以3倍信噪比（S/N）和10倍信噪比计算检出限和定量限，山茶油种9种抗氧化剂在方法检出限和定量限分别为0.4 ～ 1.0 mg·kg-1和 1.0 ～ 3.0 mg·kg-1，结果见表 1。

2.4 精密度和回收实验

在山茶油空白样品中分别按3.0 mg·kg-1、10.0 mg·kg-1、30.0 mg·kg-13水平进行加标实验，每个添加水平重复测定6次，以测定回收率，结果见表2。3个添加水平下山茶油样品中9种抗氧化剂的平均回收率为68.9%～97.6%，相对标准偏差为0.5%～4.2%。说明该方法符合山茶油中9种抗氧化剂检测的检验方法要求。

表1 9种抗氧化剂在山茶油中的线性方程、相关系数、检出限和定量限表

表2 9种抗氧化剂在山茶油中的回收率及相对标准偏差表（n=6）

2.5 样品分析

按照实验方法对42批次山茶油进行检测，结果有两批次检出PG，含量分别为46.45 mg·kg-1和57.46 mg·kg-1；2 批次检出 Ionox-100，含量分别为46.76 mg·kg-1和 54.08 mg·kg-1；9 批次检出 OG，含量为4.40～44.56 mg·kg-1；4批次检出DG，含量为21.79～31.23 mg·kg-1，其他抗氧化剂均未检出。