一种蔬菜乳酸菌发酵工艺的研究

蔬菜经发酵后含有大量人体必需氨基酸、多种维生素、矿物质和丰富的膳食纤维。目前国内制作泡菜多采用自然发酵工艺，其原理是在高浓度食盐溶液中，利用食盐的高渗透压抑制有害微生物的生长，而附着在蔬菜表面的乳酸菌不断增长成为主导菌，发酵产酸获得泡菜[1]。该方法存在发酵周期长、产品质量不稳定、亚硝酸盐和食盐含量高等弊端。为解决上述问题，人工引入纯益生菌参与蔬菜发酵，是蔬菜发酵产业的一大必然趋势[2]。本研究利用筛选出的优良乳酸菌，直接采用发酵罐模式，利用复合纯菌种冻干菌粉直投式对蔬菜进行发酵，开发出一套工业化新型发酵模式，可全程监控蔬菜发酵，有效保证了产品质量，缩短了发酵时间，有利于降低成本，过程中所有发酵指标及泡菜成品指标均能有效控制，保证工业化过程的专业性和成品质量的一致性。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

发酵剂：实验室自主研发，由植物乳杆菌A、乳酸乳球菌B以及辅料组成（活菌均≥109CFU·g-1）；蔬菜：包菜、萝卜、姜、蒜、小米椒和花椒（菜场购得）。

发酵罐：314不锈钢20 L发酵罐（有单向排气阀以及物料放料口）。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵培养基优化筛选

1#——食盐2.5%、发酵促进剂20%、食用葡萄糖2%；2#——食盐2.5%、蔬菜汁20%、食用葡萄糖2%；3#——食盐2.5%、辅料浸出液20%、食用葡萄糖2%；4#——食盐2.5%、10BX°麦芽汁20%[3]、食用葡萄糖2%；5#——食盐2.5%、食用葡萄糖2%；接种0.5 g·L-1发酵剂以及蔬菜后置于37 ℃恒温发酵36 h，检测发酵液的活菌、pH以及蔬菜总酸含量，结合口感情况进行筛选。

发酵培养基成分尽量选择食品类原材料制备。①发酵促进剂：蒜10%、姜25%、红小米椒10%，将材料洗净，用50 ℃温开水1∶1混合后浸泡30 min，榨汁机打碎，4层纱布过滤，备用。②蔬菜汁：将需要进行发酵的蔬菜与水1∶1混合进行榨汁破碎，4层纱布过滤，备用。③辅料浸出液：蒜10%、姜25%、红小米椒10%用80～100 ℃热水浸泡30 min，取浸出液备用。发酵蔬菜要求完全浸没于液体中。

1.2.2 发酵剂投菌量筛选

菌剂投加量控制，使其加入后初始乳酸菌活菌数分别为 105CFU·mL-1、106CFU·mL-1、107CFU·mL-1以及108CFU·mL-1。每6 h取一次样分别检测泡菜水的pH值和菜的总酸含量，比较发酵产酸情况，确定发酵剂的最适添加量。

1.2.3 食用葡萄糖浓度的筛选

加入一定量的葡萄糖主要是为乳酸菌前期生长提供一定的碳源，加快发酵速度，也能对蔬菜口感产生一定影响，控制其添加浓度分别为0%、1%、2%、3%和4%，36 h发酵结束后测定发酵液pH、活菌以及菜的总酸。

1.2.4 食盐浓度筛选

食盐的作用主要是维持乳酸菌生长的渗透压，促进菌体生长同时为泡菜的口感丰富一些咸香口味。控制其添加浓度分别为0%、1%、2%、3%和4%，36 h发酵结束后测定发酵液pH、活菌以及菜的总酸和亚硝酸盐含量。

1.2.5 不同蔬菜连续发酵

采用筛选出的最佳发酵培养基发酵蔬菜，在第一次发酵蔬菜白萝卜完成后，取出白萝卜真空封口包装后进行高温瞬时灭菌处理终止发酵，在原发酵液中加入新的发酵蔬菜包菜进行二次发酵，结束后再进行新鲜蔬菜三次发酵、每批次蔬菜发酵时间控制为36 h，测定菜的总酸、亚硝酸盐含量，评定蔬菜口感。

1.2.6 分析方法

（1）活菌计数：10倍梯度稀释倾注法。

（2）总酸以及亚硝酸盐测定：滴定法[4-5]。

2 结果与分析

2.1 发酵培养基筛选

根据上述1.2.1中5组培养基进行蔬菜发酵，蔬菜采用白萝卜进行试验，发酵完成检测发酵液活菌情况以及其他相应指标参数如表1所示。

表1 不同培养基发酵蔬菜参数指标表

由表1可知，1#培养基发酵情况最好，发酵液活菌高达1.5×109CFU·mL-1，产酸也高达0.65 g/100 g，说明该培养基非常适宜实验中乳酸菌生长产酸，利用其进行蔬菜发酵，发酵出的泡菜口感能媲美传统发酵的口感，为最适宜的发酵蔬菜培养基。

2.2 发酵剂投菌量试验

根据2.1筛选出的最佳培养基进行发酵蔬菜，控制乳酸菌发酵剂投菌量进行蔬菜发酵试验，发酵情况如图1所示。当发酵达36 h时，发酵剂添加量为 106CFU·mL-1、107CFU·mL-1、108CFU·mL-1时发酵产酸情况相差不大，考虑成本情况，可以选择106CFU·mL-1作为发酵剂投菌量，发酵剂活菌为2×109～ 4×109CFU·g-1，则发酵剂添加量为 0.5 g·L-1。

图1 发酵剂添加量对蔬菜发酵产酸影响图

2.3 不同葡萄糖浓度对蔬菜发酵的影响

不同葡萄糖浓度对发酵会产生一定的影响，如图2、图3、图4所示，糖添加量为1%～4%时，其对发酵液pH以及蔬菜的总酸影响相差不大，糖添加量为2%～4%时，发酵液活菌数目相差不大，糖作为碳源对菌体的生长会有一定的促进作用。从实际应用成本情况考虑，选择2%葡萄糖浓度较为适宜。

图2 糖添加量对发酵液pH的影响图

图3 糖添加量对发酵蔬菜总酸的影响图

图4 糖添加量对发酵液活菌的影响图

2.4 不同食盐浓度对蔬菜发酵的影响

添加5组不同浓度的食盐进行发酵试验，相应的发酵情况如表2所示。

表2 不同食盐浓度对发酵情况的影响表

由表2可知，食盐浓度在0%～4%均能实现蔬菜正常发酵，说明其对发酵的影响不大，但考虑到泡菜口感，选择2%～3%较为适宜。且5组盐浓度发酵蔬菜的亚硝酸盐的含量均低于5 mg·kg-1，而国家标准对酱腌菜亚硝酸盐含量要求为不高于20 mg·kg-1[6]，完全满足健康食品要求。对于传统自然发酵而言，食盐的添加量一般高达6%～10%，主要是利用高盐浓度抑制其他有害微生物生长，但高盐浓度会带来高亚硝酸盐风险，不利于人体健康。本研究的纯菌种发酵蔬菜，添加食盐主要是丰富泡菜成品的咸香口感，添加量可以根据需要调节，不会对发酵产生很大影响。

2.5 不同蔬菜连续发酵情况

在发酵液中加入白萝卜进行一次发酵36 h，发酵结束将菜取出终止发酵处理，检测相关指标，然后在原发酵液中投入新的蔬菜，包菜进行二次发酵，继续发酵36 h，结束发酵，将泡菜取出终止发酵检测相关指标。验证该发酵液能否不断投入新的蔬菜进行持续发酵，在二次发酵结束，将发酵好的泡菜取出后，再次投入新的蔬菜进行发酵，进行试验，相应结果如表3所示。

表3 连续发酵蔬菜情况表

由表3实验结果可以看出，该发酵模式只能进行二次发酵，不能持续到三次发酵，分析原因可能是菌体发酵快速大量繁殖，堆积产生的大量代谢物以及死菌体等会对发酵蔬菜的口感造成较大的影响。

3 结论

本文研究了一种蔬菜乳酸菌发酵工艺，采用实验室自制的乳酸菌冻干菌粉，采用发酵罐进行纯菌种发酵蔬菜，研究开发了一种最适宜的培养基：乳酸菌剂0.5 g·L-1，食盐2%～3%、发酵促进剂20%、糖2%，pH 6.5，37 ℃发酵36 h，发酵蔬菜总酸含量高达0.60%～0.65%，发酵蔬菜口感佳。一次发酵蔬菜结束后能加入新鲜蔬菜进行二次发酵，不影响发酵产酸和口感。目前市面上蔬菜发酵仍多数采用传统自然发酵或者发酵剂强化的半自然发酵，这些发酵模式都有一定的不可控环境因素，发酵时间较长，易发生有害微生物污染，采用食盐浓度较高，易造成亚硝酸盐超标，对人体健康不利。本研究采用乳酸菌剂纯菌种工艺发酵蔬菜，其亚硝酸盐含量较低。有研究表明，植物乳杆菌具有亚硝酸盐还原特性[7]，因此加入大量菌体后各类蔬菜中产生的亚硝酸盐被及时还原，使得乳酸菌发酵泡菜中亚硝酸盐残留低。本研究工艺发酵蔬菜成本低，低盐低糖无亚硝酸盐、绿色健康、发酵周期短，纯菌种发酵，整个发酵过程可控，泡菜产品可以实现标准化生产，便于工业化转化放大。