氮形态对沉水植物氮磷去除效果及沉积微生物群落结构的影响

程铁涵,周昕彦,曹玉成,俞佳铭

氮形态对沉水植物氮磷去除效果及沉积微生物群落结构的影响

程铁涵,周昕彦,曹玉成*,俞佳铭

浙江农林大学资源与环境学院, 浙江 杭州 311300

本文探究了在不同氮形态下沉水植物的氮磷去除效果及沉积微生物群落结构。以15 d为周期，进行4个周期的采样，分析水体氮磷的去除效果及微生物群落变化特征。结果表明：（1）苦草，马来眼子菜，仿生水草均在NH4+-N:NO3--N为2:0的处理中对于总氮的去除率最高，分别达到了85.6%，82.1%，91.3%。（2）3种沉水植物在不同处理中对于总磷的去除率相差不大，但是苦草和马来眼子菜对于总磷的去除效果远优于仿生水草。（3）不同氮形态配比会对沉积物中的微生物群落造成影响，不同处理组中沉积物的微生物OTU数目、多样性、及微生物种类都有差异，沉积物中的主要菌门如变形菌门、绿弯菌门、厚壁菌门等均在NH4+-N:NO3--N为2:0的处理中丰度更高，且NH4+-N:NO3--N为2:0的处理中的微生物群落生长更好。

氮形态; 氮磷去除; 微生物群落

氮是植物重要的营养元素,植物体吸收的氮素形态主要有无机态氮(硝态氮和铵态氮)、有机态氮如尿素等[1]。但是氮的何种形态更有利于植物的生长发育一直饱受争议。人们按植物对于硝态氮和铵态氮的喜好程度分为喜硝和喜铵植物。有研究表明铵态氮对于水稻的生长更有利[2]，而硝态氮则是对于小麦等作物的促进作用更为明显[3]，这导致了在不同种类农用地使用的化肥种类存在差异，进而影响了农田排水和河道中无机氮的形态。沉水植物和细菌作为水域自然生态体系的主要成分,对保持水域自然生态体系的稳定性起着重要作用。虽然大量研究也已证明，不同的植物种类对铵氮和硝氮有着不同的偏爱，但不同氮源的施加对植物生长的作用与效果扔一直存在着争论。同理，不同的沉水植物是否会因为不同形态氮的施加而影响对水体氮磷的去除以及不同氮形态的配比是否会对沉积物和植物根系中的微生物群落产生影响？目前，这方面的研究较为鲜见。本文通过给不同沉水植物设计不同氮形态环境，拟研究其在何种环境下对于氮磷的去除效果更好，同时探究氮形态对于沉积物微生物群落结构的影响，为今后的水环境治理提供更好的思路。

李文丽在研究中得出结论，水生植物对江河湖库等水体中的氮磷物质的迁移转化、归宿以及赋存形态产生重要影响，基于水生植物的水质净化和水生态修复也得到更多的关注[4]。湖泊中氮磷在水体和沉积物中的循环利用和沉积过程中微生物群落研究,是目前中国国内重点的科研方向和优先领域,氮素、磷素之间的跨界面(沉积物-水界面)生物转化与形态变化研究已成为现实重点。牛凤霞等人的研究表明不同氮形态下的微生物群落结构也会受到影响[5]，国内外学者的研究表明许多微生物对于生物的氮循环都有着重要影响[6-9]，不同的微生物群落结构会影响植物对氮磷等污染物的吸收。但是关于沉积物中微生物群落对于氮形态响应规律的研究较少。

本文通过选用广泛分布且廉价的两种沉水植物苦草（）马来眼子菜（Morong）和仿生水草（The bionic aquatic plants）为材料，移栽至取自太湖流域中的沉积物中，再加入预制好的不同氮形态的实验用水进行培养，通过测定水体中总氮（TN）、总磷(TP)含量，探讨不同氮形态对于沉水植物氮磷去除的影响。

目前在对细菌群落的研究中，已应用到了高通量测序技术，并找到了许多的功能细菌。有科学研究证实，在湖泊沉积物中许多细菌有脱硫除磷的功效。硝化杆菌属()、硝化螺菌属()等菌属具备硝化功用,硫杆菌()、不动杆菌属()等均为反硝化细菌，也有反硝化功用。假单胞菌属()是有除磷功用的菌种属。而变形菌株则是沉积物中的主要菌种，它在降低硝酸盐和亚硝酸盐水平的作用上也起到了很大效果。本研究采用了高通量测序技术，对在不同氮形态处理下的沉积样品进行测定，从而获取了沉积中微生物的群落组成信息，进而分析探讨氮形态对于沉积物中微生物群落的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料与装置

实验用苦草和马来眼子菜于环林生态园林工程有限公司购得，塑料仿生水草于姑苏水族公司购得。实验所需沉积物是用抓斗式采泥器采集自太湖流域（N:30°56′30″,E:120°25′29″)。人工筛除泥中粗粒及动植物残体，混匀以后作为实验所用沉积物。实验用水则是取自平山实验基地经过除氯的自来水。

如图1所示，实验装置采用PVC板制作，每个装置规格均为60 cm×30 cm×70 cm，其中每三个装置为平行实验联成一组，共有9组。装置在高15 cm处设排水口，排水管为三通设计，三个排水口分别设置阀门，以此防止排放水体进入其他装置，在装置65 cm高出单独设置进水口。相同营养元素配比的处理组各配1个2000 L的塑料储水桶。用来储水的塑料储水桶如图2所示。

图 1 实验装置实拍图

图 2 实验用水储水桶

1.2 实验设计

采用静态批式实验，安排两种水生植物和仿生水草，加相同沉积物，每种植物各设3个处理，每组处理做三个平行。在每个装置底部放约10 cm厚的沉积物，选取长势较好的苦草、马来眼子菜，截取长约15 cm的顶枝部分，和仿生水草一起分别移栽至装置中。每个装置栽种沉水植物10丛，每丛4～5株，并控制各装置中的植株大小和鲜重尽量相同。在各装置中加入配置好的不同营养盐浓度配比的实验用水至装置60 cm深，具体营养盐配比如表1所示。实验全程在平山试验基地大棚中进行，在自然光照下进行培养，培养时间为2个月。

表 1 不同装置处理

1.3 样品采集

实验由2021年6月1日开始至2021年8月结束。实验开始时记为实验第0 d，实验开始后，先取1次实验开始的初始水样，以15 d为周期配水和换水1次。每过15 d采集1次换水前后的水样，共采集4个周期的待测水样。沉积物取样2次，实验开始时和实验末期各采集1次，其中6月沉积物样本为刚从太湖流域采集回的沉积物，每个装置各取1 g混匀。8月沉积物样本则是在每个装置分别取样，每个装置采用五点取样法取样，混匀。

1.4 样品预处理及指标测定

使用水质分析仪测定水样总氮、总磷。沉积物样品先置于离心管中进行离心脱水，然后取样放置于经过高压灭菌处理后的2 mL离心管中，并储存在-80 ℃直至DNA提取。高通量测序服务由上海派森诺公司基因云平台提供(上海，中国)。

2 结果与讨论

2.1 氮形态对于不同水生植物氮磷去除的影响

2.1.1 总氮的去除由图3a可以看出苦草在不同装置中对总氮的去除率是在随着周期的增加而增加，总体来看去除效果V1＞V3＞V2，三组处理中V1的去除率在第四周期最高达到了85.6%，V2在第一周的去除率仅有47.8%，第三周去除率最高为65.1%。可以看出苦草在NH4+-N：NO3--N为2:0的水体中对于总氮的去除效果更好，在NH4+-N：NO3--N为0:2的水体中对于总氮的去除效果并不理想。图3b是马来眼子菜在不同装置中对总氮的去除率，总体来看去除效果P1＞P3＞P2。可以看出P1的去除效果在四个周期中都是最好的，去除率在62.2%-82.1%。而P2的去除率最高仅有61.6%。此结果可以得出马来眼子菜在NH4+-N:NO3--N为2:0的水体中对总氮的去除效果更优。有研究表明，铵态氮被植物吸收后在植物体内可以直接转化为有机氮，而硝态氮却要先转化为铵态氮，才能合成有机氮，因此需要消耗的能量较大，铵态氮对植物的吸收具有优先选择性，所以实验结果也和方云英等[10-13]的研究结果相吻合。而图3c仿生水草组去除率波动较大，3组处理的平均值分别为59.1%，69.8%，70.1%。第1周期3组处理去除率都很低，而2-3周期去除率显著提升，第4周期又有些下降。但是在第3周期，4组装置的去除率差别并不大，最高的B1为91.3%，这也说明了不同氮环境对于仿生水草的吸附效果影响不大。第1周去除率偏低是因为在试验处理初期，由于刚栽种了仿生水草土壤空隙比较大且投加实验用水过程产生的搅动，对系统的影响较大。

图 3 三种沉水植物的总氮去除率

Fig.3 Total nitrogen removal rate of three submerged plants

图4总体来看，V1在4个周期对总氮去除率的平均值达到了82.17%，P2组对于总氮的去除效果最差，去除率均值只有55.84%。3组栽种苦草处理中，V1对于总氮的去除效果明显优于V2，V3组，V1＞V3＞V2。3组栽种马来眼子菜处理中P1的去除效果也优于P2，P3，P1＞P3＞P2。3组栽种仿生水草处理中，B2、B3的去除效果比较接近，B1的吸附效果最差，B3＞B2＞B1。在相同处理中不同水生植物对于总氮的去除效果也有明显的不同，相同处理中，苦草对于总氮的去除效果要优于马来眼子菜，这与许多学者研究结果相一致[14,15]。

图 4 总氮去除率箱线图

2.1.2 总磷的去除通过对图5a的数据观察比较可以发现对总磷去除效果最好的是第4周期的V1，去除率为81.52%，前3个周期的3组数据相差不大。图5b的数据表明，P3组对总磷的去除效果最好，4个周期的去除率均值为68.23%。但是3种不同处理下的马来眼子菜的对总磷去除效果相差并不大。而图5c的数据可以看出仿生水草组对总磷的去除效果不佳，B2组的去除均值只有41.18%，最低值只有23.91%。由图5可以看出不同氮形态配比的水体对于植物对总磷的吸附能力影响不大，仿生水草组对总磷的吸附能力明显不如苦草和马来眼子菜。不同氮环境对于仿生水草的影响并不明显。沉水植物对磷的消除效应很大，一方面沉水植物在繁殖后可以利用根部直接吸取正磷酸盐用以生成自身所需要化合物，另一方面沉水植物的体表和根部也给聚磷菌等有机微生物创造了直接附着生存空间，这些都对水体中的磷产生了消除效应。但是不同的氮形态配比并不会影响沉水植物去除磷的效果。而经过图6比较同种处理下不同植物的对于总磷的去除率可以得出，苦草对于总磷的去除能力优于马来眼子菜和仿生水草，这与李琳等人的研究结果相符[16]。

图 5 三种沉水植物的总磷去除率

图 6 总磷去除率箱线图

2.2 氮形态对沉积物微生物群落结构的影响

2.2.1 OTU数花瓣图更直观地统计了各样本共有和独有的OTU数目，以了解它们的组成相似性及重叠情况。10个样本共有的OTU为752个，其中OTU数目最多的处理为V1，OTU数目达到了4690，OTU数目最少的处理为P1，OTU数目为3438。这说明在不同水草和氮配比环境中，菌群结构也发生了显著的变化。其中从各装置初始到4个周期后的沉积物样本中V1，V2，P2，P3，B2，B3组特有的OTU数目均有明显增加。可见，随着时间的推移，装置内微生物丰富度也在不断增加，微生物群落也变得更加稳定。

图 7 OTU数目图

2.2.2 门水平上的微生物群落组成由图8可知，10个样品中在门水平上检测出8个相对丰度较高（＞1%）的类群，10个样品共有的优势菌门为，变形菌门(39.27%～50.71%)、厚壁菌门(7.92%～23.90%)绿弯菌门(10.47%～20.54%)酸杆菌门(7.02%～9.96%)和硝化螺菌门(3.64%～5.18%)变形菌门是各装置中的第一优势菌门，自然界中一些反硝化细菌和大多数固氮细菌基本都属于该门类，在水处理工艺中占主要地位。放线菌门好氧时可吸磷，具有多样化的次级代谢，厌氧时可降解氨基酸等有机物[17-19]。绿弯菌门的存在有利于大分子难降解物质的去除[20]。厚壁菌门可降解COD和乳酸等，属于革兰氏阳性菌[21,22]。酸杆菌门可以降解植物残体、参与单碳化合物降解[23]。硝化螺旋菌门属于硝化细菌,可以将亚硝酸盐氧化成硝酸盐[24]。其中变形菌门在各装置中的丰度相差不大，在4个周期后，9组装置沉积物中的厚壁菌门相对丰度明显高于初始沉积物样品。绿湾菌门除在B1中丰度有所增长在其他样品中丰度均有所下降。9组装置沉积物中的酸杆菌门和硝化螺菌门的相对丰度相对于初始样品都有所下降。

图 8 微生物群落门水平分类组成以及相对丰度

2.2.3 属水平上的微生物群落组成 由图9可知，10个样品在属水平上检测8种相对丰度较高（＞1%）的已知属。10个样品共有的优势属有(梭菌属)（5.41%～20.04%）、酸杆菌门的（3.46%～4.83%）、（4.14%～6.45%）、变形菌门的（1.20%～1.90%）、酸杆菌门的（1.35%～1.88%）、(1.13%～2.08%)。其中在4个周期后9个样品的相对丰度均高于初始样品，且V3和P3组样品高于同植物组其他样品，B3则低于同植物组其他样品，的相对丰度在苦草组的3个样品高于初始样品，而马来眼子菜和仿生水草的6个样品则是低于初始样品。这也说明了在种植苦草的环境中更适合-菌属的生长。9个样品的相对丰度也是较初始样品都有所增加，Sva0485各组相对丰度相差不大，但是都小于初始沉积物样品，相对丰度变化和相同。在苦草组和马来眼子菜组除V2以外的5个样品的相对丰度均大于初始样品，但是仿生水草组的3个样品相对丰度则小于初始样品。

图 9 微生物群落属水平分类组成以及相对丰度

2.2.4 Alpha多样性分析Chao1指数用于指示群落丰富度，Shannon指数指示群落的多样性，Shannon指数越大，说明群落多样性越高。分析结果可知，随着时间的推移，除V1，P2组其它样品Chao1指数逐渐变小，表明其微生物的群落丰富度也在减少，可以看出不同处理不同时期微生物群落的丰度有显著差异（＜0.05）。其中，在所有装置的末期，P2的群落丰富度最高。随着时间的增加，不同植物组的Shannon指数变化并不相同，苦草组Shannon指数V1＞V2＞V3组，而马来眼子菜组则是P2的Shannon指数最高，P1的Shannon指数最低。仿生水草组则是B3＞B2＞B1。造成上述结果的原因可能是在不同植物不同氮形态配比条件下，各个装置微生物的生态系统有所差异。实验表明，3种沉水植物都对TN、TP有很好的去除效果，当各组装置微生物多样性及丰富度存在差异性时，随着各装置进水水质成分的不同，作用菌群呈现差异性。

图 10 指数箱线图

2.2.5 Beta多样性分析（1）PCoA分析由图11可以看出，即使是同一实验条件下的平行分组微生物组成差距也很大，而且都与初始样品相差很大，初始样品集中分布在第三象限。苦草组V1，V2分布在第一象限、第二象限和第四象限，而V3则集中分布在第一象限。马来眼子菜组P1和P3分布在第一象限和第四象限，P2则分布在第一象限、第二象限和第四象限。仿生水草组B1样品集中分布在第二象限，B3分布在第二三象限，B2则是在第二象限，第三象限和第四象限中均有分布。此时各处理中的微生物组成和初始样品中的微生物组成已经有了较大差距。

图 11 PCoA分析

图 12 组间差异分析

（2）组间差异分析通过图12可以看出，所有沉积物样品在不同装置中经过四个周期都与沉积物初始样品有了很大的差异，这说明，相同的沉积物在不同的沉水植物和氮素配比中所产生的微生物群落也会有很大差异。

3 结论

本文在模拟湖泊生态体系中，分别研究了不同氮形态对于不同沉水植物氮磷去除效果的影响、不同氮形态对于沉积物中微生物群落的影响，初步探讨了不同氮形态对于水体生态环境的影响机理，主要结论如下：

（1）在不同的氮形态配比下对沉水植物去除氮磷有显著影响,NH4+-N:NO3--N为2:0的条件下,沉水植物对氮磷的去除明显增加。两种沉水植物,苦草和马来眼子菜对水体中的磷均有较好的吸附效果,但是苦草吸附磷的效果，高于马来眼子菜和仿生水草；

（2）不同氮形态配比会对沉积物中的微生物群落造成影响，沉积物中的主要菌门为变形菌门、绿弯菌门厚壁菌门酸杆菌门和硝化螺菌门，不同的氮环境首先影响了沉水植物的生理响应，而沉水植物的变化又改善了沉积物中微生物的丰度和生物多样性，提高了脱氮菌和聚磷菌的微生物丰度，增强了整个生态系统对氮磷的去除效果。对于苦草来说在NH4+-N:NO3--N为2:0的环境下微生物群落丰度更高，系统更加稳定。马来眼子菜则在NH4+-N:NO3--N为0:2环境中微生物系统发展更好。而不同氮环境对于仿生水草的微生物群落影响不大。

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Effects of Nitrogen Forms on Nitrogen and Phosphorus Removal Efficiency of Submerged Plants and Microbial Community Structure in Sediments

CHENG Tie-han, ZHOU Xin-yan, CAO Yu-cheng*,YU Jia-ming

311300,

In this paper, we investigated the nitrogen and phosphorus removal effects of submerged plants and the structure of sediment microbial communities under different nitrogen forms. Four cycles of sampling were conducted with a 15-day cycle to analyze the nitrogen and phosphorus removal effects and microbial community change characteristics of the water column. The results show that (1),Morongand bionic aquatic plants had the highest removal rates for total nitrogen in the NH4+-N:NO3--N treatment of 2:0, reaching 85.6%, 82.1%, and 91.3%, respectively. (2) The removal rates of total phosphorus by the three submerged plants in different treatments were not significantly different, but the removal of total phosphorus byandwas much better than that by bionic aquatic plants. (3)The number of microbial OTUs, diversity, and microbial species in the sediment differed among treatment groups,The major phyla in the sediment such as Proteobacteria, Chloroflexi, and Firmicutes were all in higher abundance in the treatment with NH4+-N:NO3--N of 2:0, and the microbial community grew better in the treatment with NH4+-N:NO3--N of 2:0.

Nitrogen forms; Nitrogen and Phosphorus removal; microbial community

S154.3

A

1000-2324(2022)04-0560-08

10.3969/j.issn.1000-23242022.04.010

2022-02-14

2022-03-20

浙江省重大科技专项重点社会发展项目(2015C03007);浙江省重点研发计划项目(2019C03121);浙江省“三农六方”科技协作项目(CTZB-F170623LWZ-SNY1)

程铁涵(1997-),男,研究生在读,研究方向:土壤面源污染. E-mail:chengtiehan9761@163.com

Author for correspondence. E-mail:Caoyucheng@zafu.edu.cn