小柴胡汤及亚胺培南西司他丁对耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的体外抑菌效果及生物膜清除作用的机制研究

高 吟, 张立红, 张志斌, 胡锡池

(1.江苏省无锡市中医医院 检验科, 江苏 无锡, 214000;2.江苏省无锡市第二人民医院 检验科, 江苏 无锡, 214000)

鲍曼不动杆菌是革兰阴性条件致病菌, 无鞭毛，几乎无动力，在大自然中广泛存在[1]。鲍曼不动杆菌是重症监护室院内感染主导细菌之一[2]。抗生素的滥用易导致鲍曼不动杆菌产生多重耐药性[3]。耐碳青霉烯类抗菌药物对β-内酰胺酶作用稳定，临床上分离出耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌(CRAB)的数量逐年上升[4]。小柴胡汤出自东汉名医张仲景所著《伤寒论》，由柴胡、黄芩、人参、半夏、甘草、生姜、大枣等中药组成，可用于治疗伤寒少阳证，具有解表散热、疏肝和胃的功效[5-6]。本研究探讨小柴胡汤联合亚胺培南西司他丁对CRAB的体外抑菌效果及对生物膜的清除作用，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验菌株及药物来源

本研究随机选取江苏省无锡市第二人民医院2019年1月—2021年4月分离出的不同样本来源的鲍曼不动杆菌菌株，剔除同一患者相同部位分离的重复菌株。样本来源于痰液、尿液、脑脊髓、伤口脓液等标本。参考文献[7]进行小柴胡汤的药物配制。按照小柴胡汤药加水煎煮2次，每次1.5 h, 滤液浓缩; 半夏、生姜用75%乙醇浸泡24 h, 收集提取液，回收乙醇，与上述浓缩液合并，浓缩至60 ℃下相对密度为1.08～1.10的药液，喷雾干燥，制成干浸膏粉，备用。注射用亚胺培南西司他丁(上海辉瑞制药有限公司，国药准字H20067765)。

1.2 仪器与设备

VITEK-2 Compact全自动细菌鉴定仪(法国梅里埃); 96孔细胞培养板(美国Corning公司); 半自动多点接种仪(日本株式会社); 全功能微孔板检测酶标仪(美国Biotek公司); 德国Eppendorf公司PCR扩增仪。

1.3 CRAB菌株鉴定和菌悬液的配置

将采集的样本接种于麦康凯培养基进行细菌分离和培养，根据菌落具体形态选择疑似鲍曼不动杆菌的菌落进行初步分离，接种于鲍曼不动杆菌显色培养皿, 35 ℃下恒温孵育24 h。采用VITEK-2 Compact全自动细菌鉴定仪进行菌种鉴定。所有操作严格遵循使用说明书，且同一患者多次送检标本检出同一菌株按1株计算。将鉴定出的鲍曼不动杆菌进行耐药检验，最终获得60株非重复CRAB，接种至菌种保存管中，置于超低温冰箱中保存。

将冻存CRAB菌株复苏3代后，挑选4～5个菌落，接种于灭菌MHB肉汤中, 37 ℃ 培养箱增菌6 h, 此时细菌处于对数生长期，菌液采用比浊仪调整浊度至0.5麦氏浓度后，再以MHB肉汤稀释，最终将菌悬液浓度调整为1×106CFU/mL备用。

1.4 抗菌药物制备

A组药物为小柴胡汤中药提取物，最终稀释浓度为256.00、128.00、64.00、32.00、16.00、8.00、4.00、2.00、1.00、0.50 μg/mL, 共10个浓度。B组药物为亚胺培南西司他丁，最终浓度为256.00、128.00、64.00、32.00、16.00、8.00、4.00、2.00、1.00、0.50 μg/mL, 共10个浓度，备用。

1.5 微量棋盘稀释法

依据96孔板棋盘法将配制好的不同浓度的小柴胡汤(A组药)与亚胺培南西司他丁抗菌药物(B组药)两两组合，第1列加入A组药，最后一排加入B组药，药物浓度由低到高，用来测定单药最低抑菌浓度(MIC)值; 将制备好的CRAB菌液加入96孔平板的1～11列中。最后一排加入质控菌，分别设阳性对照(只加细菌，无药物)和阴性对照(只加肉汤，无细菌)。挑选适量菌落于肉汤中稀释，使最终每个孔内菌液浓度为5×105CFU/mL, 震荡后放入37 ℃孵育箱中培养20 h, 观察结果。

1.6 联合用药的药效评估

记录单独应用2种药物的MICA和MICB, 并记录96孔板中联合区域中最佳组合效应时2种药物各自的MIC值，并计算联合抑菌指数(FIC)。FIC=A组药联合时MIC值/A组药单用时MIC值+B组药联合时MIC值/B组药单用时MIC值。当FIC≤0.5时，即2种抗菌药物为协同作用; 当FIC>0.5～1.0时，即2种抗菌药为相加作用; 当FIC>1.0～2.0时，即2种抗菌药为无关作用; 当FIC>2.0时，即2种抗菌药物为拮抗作用。

1.7 小柴胡汤、亚胺培南西司他丁单独作用及联合作用后生物膜抑制实验[8]

将小柴胡汤与亚胺培南西司他丁联合效果为协同作用的CRAB接种于MHB培养基中，并接种质控菌株，在37 ℃孵育箱内培养20 h, 采用比浊仪将菌液浓度调整为1.0×106CFU/mL, 加入无菌96孔细菌培养板，采用MHB培养基分别将小柴胡汤稀释成1/4、1/16的MIC系列浓度，将亚胺培南西司他丁稀释成1/4 MIC、1/16 MIC等系列浓度。以棋盘法将不同浓度的小柴胡汤和亚胺培南西司他丁进行两两组合, 37 ℃培养24 h, 每株菌株设立3个复孔，使用结晶紫染色法进行测定，酶标仪测定570 nm下吸光度，采用A570代表生物被膜生物量, A570越高表示生物膜越强。

1.8 细菌DNA的提取及实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测耐药基因转录水平

根据细菌DNA提取试剂盒(购自上海翌圣生物科技股份有限公司)操作步骤提取细菌DNA, 采用50 μL常规反应体系。设置PCR反应条件为: 95 ℃, 5 min预变性; 95 ℃变性10 s, 60 ℃退火35 s, 65 ℃延伸30 s, 扩增35个循环; 最后72 ℃下继续延伸10 min。引物序列如下,adeJ: 上游序列为5′-ATTGCACCACCAACCGTAAC-3′, 下游序列为5′-TAGCTGGATCAAGCCAGATA-3′;CarO: 上游序列为5′-GACAACTACAGCTTTACTGCT-3′, 下游序列为5′-ACACCAACTTTACCAACTGG-3′; 内参基因选择16S rRNA: 上游序列为5′-CCTACCAAGGCGACGATCTGT-3′, 下游序列为5′-AACGCTCGCACCCTCTGTATT-3′。

1.9 统计学处理

2 结 果

2.1 不同药物对CRAB的MIC比较

小柴胡汤单独用药对CRAB生长有一定的抑制作用, MIC为32 μg/mL, 而亚胺培南西司他丁对CRAB的MIC为16 μg/mL, 见表1。

表1 小柴胡汤和亚胺培南西司他丁药物对CRAB的MIC比较

2.2 小柴胡汤联合亚胺培南西司他丁用药的抑菌情况

小柴胡汤和亚胺培南西司他丁联合作用于CRAB, 小柴胡汤浓度分别为8.00、4.00 μg/mL而亚胺培南西司他丁浓度分别2.00、1.00 μg/mL时，可抑制 CRAB的生长。不动杆菌药敏FIC=4/32+2/16=0.25, FIC≤0.5, 提示2种药物有协同作用，见表2。

表2 小柴胡汤联合亚胺培南西司他丁用药的抑菌情况

2.3 小柴胡汤、亚胺培南西司他丁单独作用于CRAB后对生物膜形成能力的影响

1/16 MIC、1/4 MIC的小柴胡汤单独作用于CRAB的吸光度与空白对照组相比，差异无统计学意义(t=2.611、2.812,P>0.05); 1/16 MIC、1/4 MIC的亚胺培南西司他丁单独作用于CRAB的吸光度与空白对照组相比，差异无统计学意义(t=1.777、2.717,P>0.05)。见表3。

表3 小柴胡汤、亚胺培南西司他丁单独作用于CRAB对生物膜形成能力的影响

2.4 小柴胡汤与亚胺培南西司他丁联合作用对CRAB生物膜形成能力的影响

与单独应用1/16 MIC亚胺培南西司他丁比较，加入1/16、1/4或1 MIC小柴胡汤联合1/16 MIC亚胺培南西司他丁后的A570值下降，差异有统计学意义(t=4.513、10.515、19.802,P<0.05)。与单独应用1/16 MIC小柴胡汤比较，加入1/16、1/4或1 MIC亚胺培南西司他丁联合1/16 MIC小柴胡汤后的A570值下降，差异有统计学意义(t=3.109、5.657、15.461,P<0.05)。见表4。

表4 小柴胡汤与亚胺培南西司他丁联合作用于CRAB的A570值比较

2.5 小柴胡汤、亚胺培南西司他丁单独用药和联合用药对CRAB外排泵基因adeJ、CarO转录水平的影响

采用RT-PCR检测小柴胡汤、亚胺培南西司他丁单独用药和联合用药对CRAB外排泵基因adeJ、CarO转录水平的影响，结果显示，与生长对照组相比，亚胺培南西司他丁组中adeJ和CarO呈低表达，联合组adeJ和CarO呈高表达。小柴胡汤与生长对照组adeJ、CarO相对表达比较，差异无统计学意义(P>0.05), 其他各组adeJ、CarO两两比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

A: 各组adeJ基因相对表达水平比较; B: 各组CarO基因相对表达水平比较。两者比较, *P<0.05。

3 讨 论

本研究发现，小柴胡汤单独用药对CRAB有一定的抑制作用, MIC为32 μg/mL; 亚胺培南西司他丁对CRAB的MIC为16 μg/mL; 小柴胡汤和亚胺培南西司他丁联合作用于CRAB可发挥协同作用。亚胺培南西司他丁是碳青霉烯类抗生素，具有抗菌谱广、抗菌活性强及耐受性良好等特点，被广泛应用于革兰阳性菌、阴性菌及厌氧菌的治疗，亦是治疗多重耐药革兰阴性杆菌的有效药物[9-10]。中药作为新的抗菌剂来源，与常规抗生素联合使用可以弥补常规抗生素治疗的缺陷，提高抗生素的治疗效果。小柴胡汤主要用于治疗少阳病寒热往来、胸胁苦满、不欲饮食、心烦喜呕、口苦、咽干、目眩等症状，具有解表散热、疏肝和胃的功效[11-12]。方中柴胡味苦微寒，可疏解少阳; 黄芩苦寒，气味较重，可清泄邪热; 半夏、生姜调和胃气，可降逆止呕; 人参、炙甘草、大枣益气和中，可扶正祛邪[13-14]。全方攻补兼施，升降协调，宣通内外，为和解良方。药理研究[15]证实，小柴胡汤具有保护肝损伤、抗胃溃疡、抗幽门螺杆菌、抗抑郁、抗菌和抗炎等作用。本研究显示，小柴胡汤单独使用对CRAB有一定的抑菌作用，而小柴胡汤和亚胺培南西司他丁联合使用可发挥协同作用，增强抗生素的抑菌效果。

本研究进一步探讨小柴胡汤和亚胺培南西司他丁联合使用发挥抗菌效果的机制，结果表明，小柴胡汤和亚胺培南西司他丁可进一步激活adeJ、CarO基因，考虑小柴胡汤和亚胺培南西司他丁联合使用后可降低亚胺培南西司他丁单独用药对CRAB的MIC, 可能是外膜孔蛋白基因CarO的激活发挥了主要作用，使小柴胡汤有效成分进入菌体内，从而联合亚胺培南西司他丁共同发挥抑制细菌生长的作用。外排泵可以输送多种化合物，与细菌多重耐药性有关。既往研究[16]表明,CarO表达下调导致进入细菌体内的亚胺培南量减少，达不到抑菌所需对的浓度，从而使细菌产生耐药性。以上研究均表明, 2种药物联用激活了部分外排泵基因表达，对细菌具有一定抑制作用。

生物膜的生成使细菌对常用抗菌药物具有更强的抵抗力，增强细菌的耐药性[17]。本研究针对形成生物膜的CRAB进行生物膜抑制实验，结果表明，小柴胡汤联合亚胺培南西司他丁具有抗菌协同作用，有抑制和清除CRAB生物膜的作用。小柴胡汤或亚胺培南西司他丁单独使用时，对生物膜的抑制作用无显著差异，可能是生物膜阻碍了药物进入，导致杀菌作用被抑制。细菌生物膜是指细菌在生长过程中黏附于生物或非生物表面，由细菌自身分泌的胞外多糖基质组成的细菌群体，是耐药基因水平转移的极好环境，可获得耐药基因[18-19]。临床分离的鲍曼不动杆菌几乎都有形成生物膜的能力, 48 h内就能够形成成熟的生物膜，且生物膜形成后需要极高的药物浓度才可清除，而体内的药物浓度通常达不到清除所需的浓度，且高药物浓度将会带来严重不良反应，并且使耐药基因水平转移并演变出生物膜形成能力高的耐药菌株。因此，临床医师在治疗此类患者时应改变治疗方针，除了将治疗重点放在预防及诊断上外，也需要及时治疗急性感染，尽量杜绝慢性感染的出现以避免生物膜的形成。

综上所述，小柴胡汤联用亚胺培南西司他丁表现出协同抑菌作用，在清除生物膜方面，小柴胡汤联合亚胺培南西司他丁虽然可提高生物膜清除率，但其不良反应很严重。小柴胡汤联合亚胺培南西司他丁可对CRAB发挥抑菌作用，其机制可能是通过激活部分外排泵基因表达而实现的。