广州地区2018-2021年非结核分枝杆菌临床分离株菌种鉴定结果分析

陈华 赖晓宇 陈品儒 胡锦兴 邓政先 许柳清 梁锋

1广州市胸科医院内一科（广州 510095）；2广东省结核病控制中心（广州 510630）

非结核分枝杆菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）［1］新菌种不断被发现，目前已逾200种（http：//www.bacterio.net/mycobacterium.html）。NTM 病的发病率和流行率在全球范围内不断上升，且分离率及菌种分布呈现明显国家和地区差异；我国幅员辽阔，气候条件差异明显，NTM 分布呈现明显的地域区别，潮热地带、沿海地区多见［1-2］。广东省处于潮热及沿海地带，笔者既往研究显示［3］，广州市NTM 菌种分离率明显高于全国平均水平［4］，而且菌种分布与全国其他地区亦有区别［4］。中国非结核分枝杆菌监测研究（CNTMS）的17 家医院中对NTM 肺 病（nontuberculous mycobacterialpulmonary disease，NTM-PD）进行前瞻性和全国性监测显示：中国约1/15 的PTB 患者伴有非结核分枝杆菌感染，NTM-PD 的比例表现出显著的地理多样性，从西北部的3.2%到南部的9.2%。胞内分枝杆菌最多，其次是脓肿分枝杆菌复合体。本研究对2018-2021年广州市胸科医院临床分离的NTM 菌株进行菌种鉴定，收治患者中NTM-PD 流行情况进行了回顾性分析，以了解广州地区NTM 的菌种分布及NTM-PD 状况变化，为NTM-PD 的防治提供参考依据，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2018-2021年广州市胸科医院住院及门诊就诊患者的痰液、支气管冲洗液、脓液、尿液、浆膜腔积液、脑脊液和穿刺物等标本进行分枝杆菌培养。

1.2 研究方法

1.2.1 细菌、试剂与仪器 结核分枝杆菌标准菌株H37Rv 由国家结核病参比实验室提供。晶芯分枝杆菌菌种鉴定试剂盒（微阵列基因芯片法）、基因芯片检测平台及配套试剂、LuxScan-10K/B 微阵列芯片激光扫描仪均购自北京博奥生物有限公司；抗原检测试剂（胶体金法）购自杭州创新生物公司；PCR 扩增仪、高速离心机购自德国Eppendorf公司；分枝杆菌细胞破碎仪购自上海仁度公司［3］。

1.2.2 菌种鉴定方法 NTM 菌种鉴定方法［4］：应用美国BD 公司BACTEC MGIT960 系统进行分枝杆菌培养；对培养所得的菌，应用成都博奥晶芯生物科技有限公司生产的分枝杆菌菌种鉴定试剂盒（DNA 微阵列芯片法）将培养菌鉴定至17 个种或群：结核分枝杆菌复合群、龟/脓肿分枝杆菌、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、戈登分枝杆菌、偶然分枝杆菌、海/溃疡分枝杆菌、苏尔加/玛尔摩分枝杆菌、蟾分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、土分枝杆菌、金色分枝杆菌、草分枝杆菌、不产色分枝杆菌［3］。具体实验操作严格按仪器与试剂说明书进行。

1.2.3 统计学方法 使用SPSS 23.0 软件进行统计分析，计量资料以（）表示，计量资料为偏态分布，采用M（P25，P75）表示；计数资料以例（%）表示，组间差异的比较采用χ2检验或Fisher 确切概率法，两组间比较用t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 标本来源分布 对临床标本进行分枝杆菌培养，培养出阳性菌株后，需患者回院做检测。其中18 501 株阳性菌采用基因芯片法进行菌种鉴定，共鉴定出结核分枝杆菌复合群11 512 株，NTM 6 558 株，无法分辨菌种431 株；NTM 菌株中，同一标本培养出2 种以上混合菌种376 株（2.03%）。分离出的临床标本来源主要为痰和支气管冲洗液94.71%（17 522/18 501），见表1。

表1 临床标本来源分布Tab.1 Distribution of clinical specimen sources

2.2 每年度NTM 分离率与性别、年龄分布特点 临床上，患者常多次行分枝杆菌培养检测，若同一病例有多次培养阳性与菌种/群鉴定结果，每年度则以1 例计算，剔除重复后6 558 株NTM共来自于4 336 例患者/年（跨年度患者有重叠），不同年度NTM 分离率、性别、年龄分布特点，见表2。

表2 2018-2021年间各年度NTM 分离率与性别、年龄分布特点Tab.2 Characteristics of NTM separation rates，sex and age distribution in each year from 2018 to 2021

2.3 每年度病例数与菌种分布特点 对来自4 336例患者/年的非结核分枝杆菌进行了菌种或复合群鉴定，种群分布达16 种，鸟-胞内分枝杆菌复合群群（M. avium complex，MAC）和龟-脓肿分枝杆菌复合群在各年度均为广州市主要NTM 分离菌种。2018-2021年间共有12 950 例患者分枝杆菌培养阳性，采用基因芯片法进行菌种鉴定，NTM的部分患者治疗效果不佳，长期培养有分枝杆菌生长，四年间同一患者仅计算一次培养阳性与菌种/群鉴定结果，共来自于3 624 例患者，NTM 感染患者分离率27.98 %（3 624/12 950）。见表3。

表3 2018-2021年各年度NTM 病例数与菌种分布特点Tab.3 Number of NTM cases and distribution characteristics of bacteria in each year from 2018 to 2021 例（%）

2.4 NTM 感染者菌种与年龄分布特点 四年间NTM 感染菌种前五位顺序为：MAC（占36.01%）、龟-脓肿分枝杆菌（占34.22%）、堪萨斯分枝杆菌（占7.89%）、偶发分枝杆菌（占7.86%）、戈登分枝杆菌（占3.78%）。3624 例NTM 感染患者，男女性别比为1∶139（1694∶1930），高峰年龄段均为51 ～70 岁（占46.36%），男女各占44.16%（748/1 694），48.29%（932/1 930）。MAC、龟-脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶发分枝杆菌等常见菌种与年龄段分布情况，见图1。

图1 各年龄段分布情况Fig.1 Distribution by age group

3 讨论

NTM 病通常属于机会性感染，与MTB 相比，NTM的毒力和致病性较低。但人与动物皆可感染，气候和地域可影响其感染情况和菌种分布。研究发现，在世界范围内NTM 菌所导致疾病的发病率呈上升趋势［5］。我国第五次结核病流行病学调查结果显示，NTM在分枝杆菌分离株中占22.9%［6］。

我国幅员辽阔，NTM 感染率和流行情况有着明显的地区差异，且与气候环境相关，某些地区其NTM 的发病率和患病率甚至超过结核病的发病率和患病率［1］。笔者既往研究显示［3］，广州市由于处于潮热及沿海地带，NTM 菌株分离率明显高于全国平均水平［3，7］。

本研究显示，2018-2021年间培养阳性的18 501 株进行菌种鉴定的标本中，NTM 菌株检出率为35.45%（6 558/18 501），4年间NTM 感染的部分患者治疗效果不佳，长期培养有分枝杆菌生长，四年间同一患者仅计算一次培养阳性与菌种/群鉴定结果，共来自于3 624 例患者，NTM 患者感染率为27.98 %（3 624/12 950）。高于第五次结核病流行病学调查的22.9 %；也高于本地区对2013-2015年NTM 分离率24.0%的报道［7］，呈明显上升趋势。世界范围而言，随着更多先进的实验室技术的发展，临床医生意识的加强，全球报道的NTM 病发病率近十年呈增加趋势［8-9］。

本研究的临床标本中，以痰及支气管冲洗液为主，共占临床标本的94.71%（17 522/18 501），痰与支气管冲洗液的NTM 总检出率为36.67%（6 426/17 522）。但不容忽视的外科手术切除的组织块培养阳性标本中，NTM 菌株分离率也高达27.34%（35/128），笔者既往研究指出，手术联合化疗治疗NTM 病能够提高患者痰菌阴转率及治疗成功率［10］。而脓液标本，则为皮肤脓肿或病灶脓液标本，NTM 菌株占21.99%（53/241），皮肤NTM 感染的特点及治疗方法的探讨，有待进一步研究。血液分枝杆菌培养阳性标本中，NTM 菌株占42.31%（11/26），随血液播散导致播散性非结核分枝杆菌病，需引起重视。在浆膜腔积液及脑脊液中，NTM分离率非常低，仅胸水3.43%（11/321）、腹水5.88%（1/17），而脑脊液和心包积液中未见有NTM 生长，NTM 感染所致浆膜腔积液鲜有报道，考虑为NTM毒力较结核分枝杆菌弱，未侵犯浆膜所致，与笔者既往研究结论相似［11］。

广州地区NTM 菌株分离率及NTM 感染者逐年增多的原因，除医患对NTM 认识程度逐渐升高，而基层医院对NTM 的检测手段有限，华南地区患者逐渐汇集至广州市胸科医院就诊有关。NTM 感染者占比低于NTM 菌株再进行菌种鉴定标本的占比，原因为结核患者，仅需要一次培养结果即可明确诊断，而NTM 确诊标准中最常用的细菌学标准2 份分开送检的痰标本NTM 培养阳性并鉴定为同一致病菌［1］，NTM 患者需至少行两次培养检测，导致NTM 感染者删除重复的概率高于结核患者，NTM 感染者总体占比减少。男性NTM 感染者（1 979例）少于女性NTM 感染者（2 357例），男女比例四年均维持在1∶1.191 水平，与笔者2016年［12］报道的结果相同，但与其他地区报道NTM 男性多于女性有所不同［13］，考虑与地域及NTM 菌种差异有关。平均年龄（52.69±17.05）岁，年龄略呈升高趋势，NTM 感染者是否呈老龄化趋势，仍需多年大样本研究进一步验证。

NTM 的菌种鉴定是目前研究的重要方向，这对于了解相关地区NTM 的菌种分布及疾病防控有重要意义。研究显示［1］我国常见的NTM 菌种中，临床相关性较好的有胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和脓肿分枝杆菌，其次是鸟分枝杆菌。本研究对来自4 336 例患者/年的非结核分枝杆菌进行了菌种或复合群鉴定，种群分布达16 种，2018-2021年NTM 菌种占比第一、二位均为MAC、龟-脓肿分枝杆菌复合群，均超过35%；第三、四、五位均为堪萨斯分枝杆菌、偶发分枝杆菌、戈登分枝杆菌，占比在3.53% ～8.88%之间，四年间菌种构成比无明显变化，MAC 和龟-脓肿分枝杆菌复合群仍为主要致病菌，与笔者既往的研究结果相同［3，12］，亦与相关研究结果一致［7，14-15］。说明广州地区近几年菌种构成比无明显变化。鸟-胞内分枝杆菌复合群群（M. avium complex，MAC）和龟-脓肿分枝杆菌复合群在各年度均为广州地区主要NTM 分离菌种。一项研究显示，非结核分枝杆菌肺病，治愈率仅36%。因此有部分患者治疗效果不佳，长期培养有分枝杆菌生长。2018-2021年间，因跨年度患者有重叠，同一患者仅计算一次培养阳性与菌种/群鉴定结果，共来自于3 624 例患者。占比前五位的菌种/群，为MAC（36.01%）、龟-脓肿分枝杆菌复合群（34.22%）、堪萨斯分枝杆菌（7.89%）、偶发分枝杆菌（7.86%）、戈登分枝杆菌（3.78%）。

但博奥分枝杆菌菌种鉴定基因芯片盒检查试剂盒仅可鉴定包括结核复合群在内的17 个种或群，4年间仍然有121 例（3.34%）的患者未能明确鉴定菌种，给临床医师与患者的诊治带来一定的困难。由于商业化菌种鉴定试剂盒纳入菌种数量有限，无法完全覆盖NTM 高流行地区实际分离到的菌种类型，导致鉴定失败或错误［17］。因此有必要寻求更完善的检查方法应用于临床NTM 菌种的鉴定。近年来具有较高的灵敏度及强大的鉴别能力的全基因组测序技术临床应用越来越广泛，尤其是在临床前阶段无法获得可能感染病原体线索的情况下，但全基因组测序技术需要相对复杂的操作技术和专业设备，目前只能在专业机构完成，并且结果的判读需要结合临床医学与微生物学知识才能做出正确的判断。

分离出MAC、龟-脓肿分枝杆菌复合群、堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌等致病的可信度较高，环境中普遍存在且常分离到的菌种，如戈登分枝杆菌、偶发分枝杆菌及土地分枝杆菌的致病率并不高。而培养鉴定为玛尔摩分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌等除需要考虑污染菌可能，还要考虑本地区菌种感染的特点、临床相关性可能等等。因为作为自然界普遍存在且普遍对消毒剂有抵抗作用的环境分枝杆菌，可以存在于患者有菌体液中，以及被污染的医疗器械，支气管镜洗涤剂或者实验室样本中，因此导致NTM 假阳性较常见，并不是所有分离出NTM 预示活动性NTM 病，临床、放射、微生物学证据才能确诊NTM 病。NTM 病原菌分布具有地域特异性［18］；故诊断上述菌种的NTM-PD 需更慎重。

有研究报道，脓肿分枝杆菌常与潮湿和高温环境有关，所以在中国南部的流行率较高。本研究龟-脓肿分枝杆菌复合群（34.22%）与刘东鑫的报道一致［19］，明显高于非南方地区的报道［18，20］。MAC（36.01%）考虑可能与其在不同地域分布及不同气候环境的发病率不同有关；本研究还发现，广州地区龟-脓肿与MAC 发病率差异不大，以及MAC 分离率低于中国东北部地区，其分离率的高低可能与其在环境中的广泛分布，尤其是在饮用水中的分布广泛有关。广州地区连续多年以MAC和龟-脓肿分枝杆菌复合群分离率最高，具有一定的地区特点［19］。因此，对NTM 患者应尽早进行精准的菌种鉴定，以避免患者的治疗方案错误，造成不必要的经济及心理负担。

研究表明，NTM 菌种的分布具有地域差异，受纬度、温度、湿度及患者个人的工作生活条件等因素的影响［20］。世界各地，NTM 菌种分布均有地域特点［21-25］，本文与同属华南地区的海南研究结果MAC 和龟-脓肿分枝杆菌复合群的菌种分布比例相似［26］，也符合龟-脓肿分枝杆菌复合群在南方地区的分离率高的特点，但MAC 仍然是中国各地域最多见菌种。如胞内分枝杆菌在中国不同地区的分布具有地理多样性，其流行率随纬度的降低而逐渐明显下降；但与广州市邻近的深圳市NTM 流行率相比，与本研究结果不同，2013-2017年深圳市非结核分枝杆菌流行状况显示年NTM 菌株的检出率仅为4.14%，各年度检出率差异无统计学意义，并无南方地区分离率逐年上升的特点；其NTM菌种分布依次为脓肿分枝杆菌（41.64%）、MAC（22.18%）、堪萨斯分枝杆菌（16.04%）、戈登分枝杆菌（8.87%）、偶发分枝杆菌（6.48%）［27］，与本研究结果比较菌种的排序和MAC 的检出率有较大的差别，分析原因：NTM 检出率与病原菌分布除具有地域特异性，入口流动性相关，NTM 流行的区域差异还要归因于本地区的感染者的NTM 环境暴露因素。

本研究NTM 多为21 ～80 岁患者，发病年龄方面，以老年人居多，发病年龄主要集中于51～70 岁（占46.36%），在MAC、龟-脓肿分枝杆菌复合群、堪萨斯分枝杆菌的菌种中，20 岁以下及80 岁以上者少见，均少于5%。广州地区NTM-PD 好发年龄仍以老年女性为主，与笔者既往的研究结果相同［3，12］，与既往本地区的研究报道相似（55 ～74 岁/47.6%）［4］（55 ～74 岁/41.35%）［7］；与深圳报道差异较大，据分析：深圳地区属于新发展劳动密集型移民城市，人口构成相对年轻化，以年轻劳动力为主，老年人的基数相对较低，导致年长者的NTM检测率相应降低［27］。

另外与国内其他地区报道NTM 病中男性多于女性［28］不同，基于全国17 个中心研究显示，女性、老年人和支气管扩张或COPD 患者是NTM-PD 的高危人群［4］，与本研究结果相似。推测NTM 病多见于低血清雌二醇水平的老年妇女［29-30］。因此，性激素可能在女性NTM-PD 易感性中起重要作用。本研究的MAC 患者中：51 ～70 岁占61.09%（413/676）；龟-脓肿分枝杆菌复合群患者：有两个高峰年龄段，分别为21 ～30 岁和51 ～70 岁共占59.00%（390/661）；堪萨斯分枝杆菌患者，年龄段分布无高峰段；三种NTM 菌种年龄段分布，差异有统计学意义（Z= 156.947，P＜0.001），与国内外研究结果相似［22，31-33］。

综上所述，广州地区NTM 的检出率处于逐年上升状态，多年来菌种分布以龟-脓肿分枝杆菌、鸟-胞内分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌为主的稳定状态，中老年患者易感，女性人群应重点关注；探讨更适用于临床常规使用的菌种鉴定技术是目前提高精确诊断的重要环节。