两种细胞在测定重组鸡α干扰素生物学活性中的比较

2022-10-18谢彩华

河南畜牧兽医 2022年18期

王翠，谢彩华，钱勇

（河南省动物疫病预防控制中心，河南郑州 450008）

鸡病毒性疾病对养鸡业危害严重，目前在兽医临床上尚无特效药物可以治疗。干扰素是一类动物机体产生的具有多重生物学功能的蛋白质，它能够激活机体内抗病毒效应从而起到抗病毒作用。尤其是α干扰素，其属于细胞水平上的广谱抗病毒、抗肿瘤和具有免疫激活功能活性的细胞因子，其主要通过抑制病毒增殖、增强抗肿瘤活性以及加强NK 细胞活性，增强其杀伤病毒感染细胞的能力，是一类具有临床应用价值的抗病毒制剂。重组鸡α干扰素（recombinant chicken interferon α，rChIFN-α）是鸡α干扰素和白细胞介素2基因的融合表达蛋白，在鸡体内外均具有α干扰素和白细胞介素-2蛋白的双重生物学活性，适宜剂量的rChIFN-α在鸡体内具有显著的抗病毒活性和免疫增强活性，是潜在的基因工程抗病毒制剂。

目前我国尚无rChIFN-α生物学活性测定方法国家标准，由农业农村部主编的《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》（2001 版）猪白细胞干扰素、《中国药典》“注射用重组人干扰素α1b”、“重组人干扰素α1b 注射液”都是采用细胞病变抑制法测定生物学活性。该文参照目前公认的“微量细胞病变抑制法”（简称CPE 抑制法），采用鸡胚成纤维细胞（CEF）/水疱性口炎病毒（VSV）、鸡成纤维细胞系（DF-1）/ 水疱性口炎病毒（VSV）测定了3 个批次的rChIFN-α抗病毒活性，比较了CEF和DF-1两种细胞的优劣，选择出了成本低、操作便捷的细胞，为后续rChIFN-α的深入研究提供了参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

DMEM 高糖培养基和D-Hanks 缓冲液为武汉博士德生物公司产品；胎牛血清为Sera Pro 公司产品；胰蛋白酶-EDTA消化液和青链霉素混合液（100X）为北京索莱宝科技有限公司产品。

1.1.2 主要仪器设备

二级生物安全柜为青岛海尔生物产品；二氧化碳培养箱为美国Thermo 公司产品；倒置荧光显微镜为日本尼康公司产品；恒温水浴锅为上海跃进医疗器械厂。

1.1.3 细胞与毒株

细胞与毒株DF-1 细胞购自武汉普诺赛声明科技有限公司；9日龄SPF鸡胚购自乾元浩（郑州）生物药厂；水泡性口炎病毒毒株（VSV毒株），由河南省动物疫病预防控制中心保存；重组鸡α干扰素由河南省动物疫病预防控制中心制备与保存，批号分别为202101、202102和202103。

1.2 方法

1.2.1 CEF细胞的制备

二级生物安全柜中取出9日龄SPF鸡胚，外壳进行消毒，然后用镊子打开气室，取出鸡胚体于一次性无菌平皿中；剪去头、四肢和内脏，采用PBS洗涤2次后，剪碎胚体，PBS再洗涤2次；加入25 mL DMEM高糖培养基和5 mL胰蛋白酶-EDTA消化液，置于37 ℃细胞培养箱中消化20 min后，弃去培养基；加入40 mL 含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，用吸管反复吹打数次以使细胞团块分散成为单个细胞；将分散均匀的单个细胞混合物加入96孔细胞培养板中，每孔100 μL，5% CO2、37 ℃培养箱中培养24 h。

1.2.2 DF-1细胞的传代培养

取培养至单层、长势良好的DF-1细胞，胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基重新悬浮；按100 μL/孔的量加入96孔细胞培养板中，置5% CO2、37 ℃培养箱中培养24 h至细胞长满单层，备用。

1.2.3 样品稀释与细胞混合

3 个批次待检rChIFN-α样品由21至225进行连续2 倍倍比稀释。待96 孔培养板中的CEF 和DF-1 细胞长至铺满单层，用D-Hanks 液洗涤细胞两次，将上述稀释好的待检样品依次分别加入CEF和DF-1细胞中，每个稀释度重复4孔，同时设置细胞对照组。置37 ℃5% CO2培养箱培养24 h左右。

1.2.4 加入VSV病毒

24 h后，以100 TCID50/ml的浓度加入VSV，每孔100 μL。同时设置病毒对照组。置37 ℃5% CO2培养箱培养24～48 h左右。

1.2.5 观察结果

加入VSV 病毒24～36 h 左右，电子显微镜下观察细胞形态，若细胞对照组中各孔的细胞形态和生长良好，而病毒对照组中各孔细胞形态出现皱缩、变圆、破碎、脱落，有75%～100%细胞出现明显的病变和死亡，则说明该次试验设置的对照系统成立，试验结果可信。

1.2.6 生物学活性单位计算

按照Reed-Muench 法计算试验结果，计算公式为：距离比=（高于50%的百分数－50）/（高于50%的百分数－低分50%百分数）=（80－50）/（80－20）=30/60=0.5。即此批次rChIFN-α待检样品稀释到2-17.5（1∶185 364）时能保护半数细胞免受VSV病毒攻击损害。该批次rChIFN-α样品的效价即为185 364 单位，因此得出干扰素的国际单位（以IU表示）。

2 结果

2.1 显微镜下观察

3 个批次的rChIFN-α细胞病变孔数与细胞病变程度比较；CEF和DF-1细胞对照组细胞正常，病毒对照组出现病变典型。

2.2 结果计算

2.2.1 rChIFN-α在CEF细胞上生物学活性计算结果

3 个批次rChIFN-α能抑制50%细胞病变的干扰素稀释度的对数log2X均为22，即rChIFN-α（0.1 ml）稀释到2-22时能保护半数细胞免受损害，计算X=4.19 107IU/ml，即rChIFN-α的效价为4.19 107IU/ml（见表1）。同等试验条件下细胞对照组各孔细胞状态和长势良好，病毒对照组各孔细胞均出现病变或死亡。

表1 重组鸡α干扰素在CEF细胞上生物学活性测定

2.2.2 rChIFN-α在DF-1细胞上生物学活性计算结果

3个批次rChIFN-α能抑制50%细胞病变的干扰素稀释度的对数log2X分别为22、22、21，即rChIFN-α（0.1 ml）稀释到2-22和2-21时能保护半数细胞免受损害，计算X=4.19 107IU/ml、X=4.19 107IU/ml X=2.10 107IU/ml，即rChIFN-α的效价为4.19 107IU/ml、4.19 107IU/ml、2.10 107IU/ml。

同等试验条件下细胞对照组各孔细胞状态和长势良好，病毒对照组各孔细胞均出现病变或死亡。该研究过程发现高浓度的rChIFN-α会导致CEF和DF-1细胞死亡，表明rChIFN-α在CEF 和DF-1 两种细胞上抗VSV 活性存在最适作用浓度，并非浓度越高抗VSV活性越好。

2.3 结果比较

在CEF 和DF-1 细胞上对3 个批次rChIFN-α生物学活性进行测定，计算得出rChIFN-α在CEF和DF-1细胞上生物学活性效价分别为4.19 107IU/mL、4.19 107IU/mL、4.19 107IU/mL 和4.19 107IU/mL、4.19 107IU/mL、2.10 107IU/mL，结果表明差异不显著（P值＞0.05）。