不同提取方法下黄穿生制剂对鸡大肠杆菌的体外抑菌作用

王志伟 ， 李超雷 ， 彭志领 ， 王志刚

(1. 郑州市农业综合行政执法支队 ， 河南 郑州 450053 ； 2. 河南省睢县动物卫生监督所 ， 河南 睢县 476900)

研究发现中药在抗大肠杆菌内毒素及消除大肠杆菌耐药质粒中发挥重要作用[1-2]。黄芪、穿心莲、生姜3味中药在治疗鸡大肠杆菌病时，入药频率较高[3-7]。生姜含有抑菌活性成分，其对大多数细菌有一定的抑制作用，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、肺炎克雷伯菌和白色念珠菌等[8]。穿心莲具有抗炎、保肝利胆、免疫调节等多种药理作用[9]。黄芪的药理作用包括保护心脑血管、肺功能、肾组织、肝损伤、肠功能，提高免疫功能，调节血压和抗氧化应激等[10]。中药不同于一般化学药物，其化学成分十分复杂，中药复方中多味药材配伍发挥功效不是简单的化学分子叠加，每味药材对不同疾病发挥功效的成分不同。因此，中药有效部位的提取方法在研究中尤为重要，发展有效且适宜的提取方法及研究方法是辨识中药活性部位的关键。中药有效部位是其发挥药物疗效的物质基础，是中药现代研究的关键[11]。本试验应用家禽感染性疾病入药频率高的黄芪、穿心莲、生姜3味中药进行组方(黄穿生制剂)[3]，采用3种不同的制药方法，观察其体外抑菌效果，为中药制剂防治鸡致病性大肠杆菌病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 原料与试剂：黄芪(Astragalusmembranaceus)、穿心莲(Andrographispaniculata)和生姜(ZingiberofficinaleRoscoe)3味中药，均购自郑州某大药房。菌种：鸡源性大肠杆菌O1型、O2型、O35型和O137型，均由中国兽医药品监察所分离保存和鉴定。培养基：营养肉汤培养基(蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉、氯化钠、水)、营养琼脂平板培养基，均购自北京陆桥技术有限责任公司，置于4 ℃冰箱冷藏保存。

1.2 主要仪器 LRH-150型恒温生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；DHG-9245A型电热恒温鼓风干燥箱，北京恒泰丰科试验设备有限公司；KQ-300B型超声波清洗器，广州沪瑞明仪器有限公司；FA1004 N电子天平，河南兄弟仪器设备有限公司；SW-CJ-1B型超净工作台，苏州净化设备有限公司；SHZ-ⅢB型循环水真空泵，上海英化仪器设备有限公司；YH-350Z型全自动不锈钢双层立式电热蒸汽压力消毒器，镇江市科密仪器仪表有限公司；SYZ-C型双重纯水蒸馏器，绍兴市上虞道科仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 试验药剂的制备 煎煮法[12]制备试验药Ⅰ(组1)，取中药材黄芪、穿心莲、生姜分别粉碎，过60目筛。然后，称取粉碎的黄芪30 g、穿心莲50 g、生姜50 g，置于煎药器中浸泡0.5 h后，煎煮1.5 h，过滤；煎3次，后2次各1 h。制备过程：煎煮→浓缩→收膏→干燥→成品，作为试验药Ⅰ。超声波+煎煮法制备试验药Ⅱ(组2)，称取粉碎的3种药物，放入烧杯，加水适量，超声波处理20 min后，将其倒入煎药器中，先煎煮1.5 h，过滤；再煎3次，后2次各1 h。合并滤液，浓缩，收膏，干燥备用，作为试验药Ⅱ。索氏提取法[13]制备试验药Ⅲ(组3)，3种药材称量好后用75%乙醇作为浸出溶媒，超声波预处理30 min后，置于索氏提取器中回流提取4～8 h。用旋转蒸发仪回收乙醇，干燥备用，作为试验药Ⅲ。

测定试验药Ⅰ、药Ⅱ、药Ⅲ的得膏率：精密量取50 mL的药液上清液，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于烘箱中105 ℃干燥3 h，置于干燥器中冷却0.5 h，迅速称量，即可得药膏量，依据公式计算得膏率。得膏率/%=药膏量/生药量×100%。

1.3.2 药敏片的制备 用打孔机制作直径为6 mm左右的圆形滤纸，50张1份。然后，将制作好的滤纸分别装入标记药Ⅰ、药Ⅱ、药Ⅲ的小青霉素瓶中，用牛皮纸封瓶口进行高压(121 ℃ 15 min)，烘干备用[14]。干燥保存的煎煮法、超声波+煎煮法和索氏提取法制取的中药膏剂，分别用蒸馏水配制成浓度为2 g/mL的试验药液。用微量移液枪分别吸取500 μL试验药液药I、药Ⅱ、药Ⅲ于装有50个纸片的小青霉素瓶中，60 ℃干燥2～4 h进行密封，置于4 ℃冰箱冷藏保存。

1.3.3 试验菌悬液的制备 活菌计数法是在一定浓度的定量药物内加入定量的试验菌，经过一定时间培养后，取样进行活菌计数，而后使用灭菌生理盐水稀释到2×107个/mL，作为试验用菌悬液[15]。

1.3.4 药敏试验 纸片扩散法：将200 μL菌悬液接种在普通琼脂培养基上，逐次将药Ⅰ、药Ⅱ、药Ⅲ的药敏片贴在涂有细菌的培养基上，保持药敏片之间的距离约2 cm，平皿壁和药敏片之间的距离约1.5 cm。在3个接种细菌的平板上分别涂上各自标号的药液，制作6个相应抗原型的细菌平板。接种后的培养皿在37 ℃恒温箱中培养24 h，而后测量抑菌圈直径并判定敏感性。药物敏感试验判定标准为抑菌圈直径：≥20 mm为极敏，15～19 mm为高敏，10～14 mm为中敏，≤10 mm为低敏，0 mm为不敏。

管碟法：试验药液进行2倍稀释。分别将5 mL营养肉汤依次加入到10支试管中，量取试验药液5 mL放入第1支试管中，混匀，而后吸取5 mL混合液体放入第2支试管中，逐次稀释到第9支试管，其中第8支试管中弃去5 mL混合液体。将1.3.3中配制的菌悬液加到10支试管中，每支试管均加200 μL菌液，放入37 ℃恒温箱进行增菌培养18～24 h。从10支试管中分别吸取200 μL培养物均匀涂在普通琼脂培养基上，而后在37 ℃恒温箱中培养24 h，再计算其最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。管碟法判定标准：平皿上的菌落数在10～20个的最小稀释度的药物浓度即为MIC[15]。

1.4 统计学方法 试验数据采用SPSS 24.0软件进行t检验分析，结果表示为平均值±标准差，P<0.05为具有显著性差异，P<0.01为具有极显著性差异。

2 结果

2.1 试验药剂的制备 试验中各取3份样品采用3种方法进行制备，采用煎煮法获得的药膏量为5.815 2 g，超声波+煎煮法获得的药膏量为8.236 8 g，索氏提取法获得的药膏量为16.121 2 g。

3种制备方法获得的药Ⅰ、药Ⅱ、药Ⅲ的得膏率结果见表1，3种制备方法得膏率由低到高依次是煎煮法、超声波+煎煮法、索氏提取法。

表1 3种方法获得的得膏率Table 1 Relative recovery rates of three extraction methods

2.2 药敏试验

2.2.1 纸片扩散法 3种方法提取的中药制剂对O1型、O2型、O35型和O137型大肠杆菌的平均抑菌圈结果如表2所示，与煎煮法制备的药剂相比，O1型、O2型、O35型和O137型4个型大肠杆菌对索氏提取法制取中药制剂的敏感程度有极显著性差异(P<0.01)，而对超声波+煎煮法制取中药制剂的敏感程度有显著性差异(P<0.05)。表明对细菌生长繁殖抑制效果由弱到强依次是煎煮法制备的药剂、超声波+煎煮法制备的药剂、索氏提取法制备的药剂，即索氏提取法制备的药剂抑菌效果最好。

表2 3种方法提取的黄穿生制剂对4种不同血清型大肠杆菌的抑菌圈直径Table 2 Diameters of inhibition zone of three Huangchuansheng preparations on four different serotypes of E. coli (mm)

2.2.2 管碟法 3种方法提取的中药制剂对O1型、O2型、O35型和O137型大肠杆菌的MIC 和MBC结果如表3所示，索氏提取法制备的中药制剂的MIC和MBC值最小，而煎煮法制取的中药制剂的MIC和MBC值最大。大肠杆菌对索氏提取法制得的中药制剂表现为中敏，对超声波+煎煮法和煎煮法制得的中药制剂表现为低敏。

表3 3种方法提取的黄穿生制剂对4种不同血清型大肠杆菌的MIC和MBCTable 3 MIC and MBC of three Huangchuansheng preparations against four different serotypes of E. coli (g/mL)

3 讨论

陈赟[16]研究煎煮法提取赤芍中芍药苷的方法，此法工序繁琐、煎煮时间长，但煎煮法是我国最早使用的传统的浸出方法[17]。杨荣华[18]研究超声波法提取银杏叶中黄酮类化合物的工艺，发现超声提取的提取率比溶剂法提高了约1.5倍。近年来，索氏提取法在中药提取方面应用较多，其具有得膏率高、有效成分损失少、周期短等优点[19-20]，在中药制剂生产中具有广泛的应用前景。本试验结果与之前报道的中药制剂提取方法的研究结果[21]一致，可见，一般中药制剂提取可优先选择索氏提取法。

中药含有多种天然的活性物质成分，主要有生物碱、有机酸、活性多糖类、黄酮类化合物、苷类、挥发油、蒽醌类、活性多糖等[22]。中药含有的活性物质不仅对病原体有直接杀灭作用，还可间接通过调节整个动物机体系统的平衡状态，使机体提高自身的免疫力起到抗菌作用[23-24]。本试验使用家禽感染性疾病入药频率高的黄芪、穿心莲、生姜3味中药，采用不同的提取方法进行体外抑菌试验，采用纸片扩散法和管碟法2种药敏试验方法，比较了3种不同的中药提取方法(煎煮法、超声波+煎煮法、索氏提取法)制备的黄穿生制剂对4种鸡源大肠杆菌的抑制效果，结果显示索氏提取法制备的药剂抑菌效果最好，该试验结果与之前报道的研究结果[21，25]一致。在本试验条件下，黄穿生制剂并没有表达出最好的效果，说明3味中药的配伍比例还有待于改善。

本试验对黄芪、穿心莲、生姜3种中药制剂采用3种提取方法(煎煮法、超声波+煎煮法、索氏提取法)制备药剂，得膏率存在一定的差异，其中索氏提取法得膏率最高，煎煮法得膏率最低；纸片扩散法和管碟法2种药敏试验结果显示，3种提取方法制备的黄穿生制剂对4种鸡源性大肠杆菌有一定的体外抑制作用，且索氏提取法制备的中药药剂抑菌效果较好。本试验为进一步研发中药制剂防治鸡致病性大肠杆菌病提供参考。