地塞米松治疗枪弹伤致兔开放性骨缺损合并海水浸泡的实验研究

陈肖松，张淦，刘胜杰，马武秀，陈聪聪，吴成如

(中国人民解放军联勤保障部队第九〇一医院，1.骨一科；2.骨二科，安徽合肥 230031)

骨缺损是战争中常见的损伤，火器伤导致的骨缺损因局部组织血运遭到严重破坏导致无法获取充足的氧气和营养，常出现延迟愈合。海战及登陆作战时，骨缺损常伴有海水浸泡，海水含多种致病菌，其还有渗透压高以及高碱性的理化特点，影响受损组织的修复[1,2]。本研究制作火器伤致兔开放性骨缺损合并海水浸泡的动物模型，经静脉注射地塞米松治疗，旨在观察其效果，并分析其中的机理。

1 资料与方法

1.1 动物选择及其相关分组

选择56只日本大耳家兔(安徽医科大学提供)，体重(2.5±0.43)kg。按随机数字表法，将实验动物随机分为A、B两组各28只，A组为空白对照组，B组为地塞米松治疗组。每组分为1 d、3 d、1周、2周、4周、8周、12周7个亚组，每亚组4只兔子。

1.2 设备及仪器

人工海水由海盐配制(国家海洋局第三研究所提供)。MDA、SOD试剂盒，Olympus光学显微镜(日本)，Pixel LINK 1394 Camera显微镜(美国)。超声破碎仪，离心机，紫外可见光分光光度计。枪支及弹丸指标：中国东风速射运动手枪SS04型，口径为5.6 mm，初速(V10)210～240 m/s，使用直径5.6 mm枪弹。

1.3 方法

(1)动物手术方法：将20%乌拉坦(4 mg/kg，国药集团化学试剂有限公司，国药准字Q31/0106000055c444-2020，批号：20210907)通过耳缘静脉注射进行麻醉，将实验动物固定于支架上，随机选择单侧后肢对准股骨中段进行枪击，枪口距离20 cm，造成股骨开放性骨缺损，伤后患肢均行简单固定及包扎，将伤肢浸泡于人工海水1 h，水温控制在21℃，室温25℃。A组(对照组)：行常规清创+股骨复位内固定术，一期闭合伤口。B组(地塞米松治疗组)：行常规清创+股骨复位内固定，一期闭合伤口，立即于静脉注射地塞米松注射液(5 mg/kg，山东辰欣药业股份有限公司，国药准字H37021969，批号：2108302212)。所有动物均置于动物房中饲养，青霉素粉针剂(华北制药股份有限公司，国药准字H13020657，批号：F1042106)40 WU肌肉注射1次/d×3 d，定时换药，伤后愈合后拆线。

(2)取材与石蜡切片制作：各亚组于术后1 d、3 d、1周、2周、4周、8周、12周各取4只兔，取各实验组动物骨缺损周围组织100 mg，移入玻璃匀浆器中，加1 mL匀浆介质，使组织匀浆化。将浆液放入离心管中，4000 rP/min离心10 min，弃上清液，加入预冷的0.05 mol/L pH为7.8的磷酸缓冲液，0～4 ℃下超声波破碎, 破碎液在10000 rP/min的4℃离心机中离心30 min，上清液即为粗酶液，-20℃保存备用。另外，于伤肢股骨骨缺损处截取标本，10%的甲醛处理标本，固定24 h，硝酸溶液脱钙，制成石蜡切片，厚度5 μm。

1.4 观察指标

(1)一般情况的观察：实验用兔子是否存活，伤口是否感染等。

(2)影像学观察：伤后4周、8周、12周，实验兔在麻醉后行X线摄片，观察枪弹伤造成伤肢股骨骨折及骨缺损的愈合情况，并经相关仪器测得骨缺损部位的骨痂灰度值。灰度值测定方法：在X线机下拍摄实验动物患肢正侧位片，随机于胶片上骨缺损区域取3个相应观测点，用相关图像软件(Photoshop cc2021)分析各点骨痂灰度值，并取其平均数值作为指标。

(3)组织学观察：骨标本脱钙、制作石蜡切片、H-E染色后，光镜下观察骨折处肉芽组织、纤维组织、软骨细胞和骨细胞等生长情况。

(4)动物标本骨缺损周围组织中MDA含量、SOD活力测定：MDA含量采用TBA比色法测定，吸取离心的上清液0.2 mL和1.8 mL蒸馏水(对照加2 mL蒸馏水)，加入2 mL的0.6%TBA溶液，混匀物于沸水浴上反应15 min，迅速冷却后再在4000 rP/min下离心10 min。取上清液测定532 nm波长下的消光度，用比浓度表示MDA(nmoL/mg)含量。SOD测定采用黄嘌呤氧化酶法，取上清液，按照试剂盒说明书配制相应溶液，在560 nm波长下测定各管的OD值，计算SOD活性。用比活力表示SOD(U/mg)活力。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 一般情况观察

所有实验动物均存活，伤口无明显感染，均愈合，予以拆除伤后缝线，骨缺损临床愈合后，动物活动能力良好。

2.2 影像学观察

术后4周A、B两组骨缺损区有薄云状骨痂阴影，术后8周两组骨缺损部位组织阴影较4周时增强，少部分外骨痂形成板层状或梭形且规则。术后12周，两组动物骨缺损处均形成骨性连接，但髓外皮质尚未完全塑性，部分动物的髓腔未完全再通(见图1)。A组及B组动物骨缺损区在不同时间点的平均骨痂灰度值见表1，A、B两组间差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 伤后4、8、12周动物伤肢X线片观察

表1 实验动物骨缺损区域X线片平均骨痂灰度值

2.3 组织学观察

术后第1天，A组挫伤区肌纤维大片坏死，部分区域组织仅见一些残存的结缔组织和少量肌组织碎片，伴有大量炎细胞浸润，间质血管淤血，大量出血。震荡区发生大片继发性肌变性坏死，肌纤维排列紊乱，间质严重水肿、淤血，有中等量炎细胞浸润，灶性出血。B组标本各区炎症反应、水肿程度及范围方面均较A组减轻。术后4周，A、B组均以纤维组织增生为主，未见明显软骨组织增生，偶见骨样组织形成，可见少许血管增生。术后第8周，A、B两组可见少量软骨细胞，骨样基质形成，未见不规则骨小梁。术后12周，A、B组少量成熟板层骨，不规则骨小梁形成，骨小梁窄细、稀少，部分髓腔内未见骨小梁。术后两组成骨质量无明显差别(图2)。

HE染色×100

2.4 动物标本骨缺损区域MDA含量以及SOD活力测定

伤后1 d、3 d、7 d、2周、4周时，A组标本中MDA含量显著高于B组，SOD活性显著低于B组(P<0.05)；而在8、12周时，两组标本中MDA含量及SOD活力无明显差异(P>0.05)，见表2-3。

表2 两组伤后骨缺损区域各时相点MDA含量比较(nmol/mg)

表3 两组伤后骨缺损区域各时相点SOD活力比较(U/mg)

3 讨论

由于特殊的作战环境，参加海战及登陆作战的伤员在伤后常伴有长时间的海水浸泡。火器伤经海水浸泡后，会明显增加伤员的死亡率和致残率，并对指战员士气造成重大影响，降低部队的战斗力，无法有效完成作战任务，是后勤医疗保障部门必须重视和解决的难题[3]。

与淡水相比较，海水渗透压高、含碱量高，同时携带多种细菌，是一种中等浓度的强电解质溶液[4]。损伤的机体经海水浸泡后，可导致机体高渗性体液转移，从而引起微循环供血的缺乏，组织如果出现缺血缺氧的状态，氧自由基及超氧化物的聚集可诱发过氧化脂质反应[5]，产生大量炎症细胞，刺激多种炎症因子释放，激活体内氧化应激系统，导致病情进一步发展，最终致受损组织周围血管通透性增大，间质水肿，反复恶性循环、严重损伤机体组织[6,7]。根据研究表明，动物肢体被火器致伤、再经海水浸泡后，机体组织受到的伤害会更加严重[8,9]。本实验中的动物肢体火器伤浸泡于人工海水后，病理切片光镜下观察显示，A、B两组动物的患肢伤道周围均出现原发伤道区、挫伤区及震荡区，部分肌纤维断裂，变性坏死，间质轻度水肿，血管淤血，各区均有不同程度的炎细胞浸润。该结果与相关海水浸泡伤研究中组织损伤的表现一致[10,11]。

地塞米松具有抗炎、抗过敏等多种功能，在创伤后的自由基生成和脂质过氧化的抑制等方面得到了广泛的应用[12-14]。地塞米松可以增加肺组织中PaO2的浓度，减轻肺组织的损害，并能抑制肺组织中SOD活性及TNF-α、IL-1β、IL-8的表达，从而降低肺组织中嗜酸性白细胞的侵袭和激活[15]；另一项研究显示，地塞米松可减轻感染后大鼠肺组织的水肿，降低肺组织MDA含量、MPO活力、增强SOD活力、抑制自由基和脂质过氧化，从而减轻对小鼠的伤害，降低死亡率，证明了地塞米松具有抗炎症的作用[16]。MDA是一种重要的脂质氧化产物，其作用机制是通过对线粒体呼吸链复合体和线粒体关键酶的合成，从而通过MDA的浓度来间接地反映细胞损伤。SOD是一种存在于生物体中的抗氧化金属酶，能促进氧自由基的自由基歧化，产生氧和过氧化氢，SOD的活力是反映人体自由基代谢状况的一个重要指标，对机体的氧化、抗氧化平衡有重要影响，SOD的水平可间接地反映机体对自由基的清除能力。本实验中，伤后第1天，A组动物组织损伤严重，伴有大量炎细胞浸润，间质严重水肿、淤血，炎症反应明显；B组经地塞米松治疗后，标本中可见炎症反应、水肿程度及范围方面均较A组减轻，同时伤后1 d、3 d、7 d、2周、4周时，A组标本中MDA高于B组，SOD活性低于B组。结果表明，在海水浸泡后，地塞米松在损伤早期确实能够有效抑制火器伤导致的组织周围炎症反应，减轻过氧化脂质反应，保护损伤的机体组织，这与多数研究的结论相一致[17-19]；但是在伤后中远期，影像学表现及骨缺损区域各时相点平均骨痂灰度值的比较证实，两组动物伤后4～12周的骨缺损愈合程度并无明显差异。组织学上，术后4周、8周、12周时，两组成骨质量也无明显差别；在8周和12周时，两组标本中MDA含量及SOD活力也无明显差异。以上结果表明，在伤后中远期，地塞米松对于损伤组织的周围炎症抑制及缓解过氧化脂质反应作用并不明显；而从骨缺损愈合的结果来看，地塞米松对于火器伤导致的骨缺损合并海水浸泡并无明显促进愈合的作用。