亚硝酸盐对氨水法测定碳氧血红蛋白的影响

王 乐，刘 捷，丁 斌，张瑞先，关江玲，滕汉飞，柴盼盼

（1.南京森林警察学院，南京 210023； 2.云南大学，昆明 650500；3.兰州铁路公安处刑事技术支队， 兰州 730030；4.甘肃省公安厅刑侦局，兰州 730030；5.甘肃省第三人民医院，兰州 730030）

一氧化碳为常见含碳物质燃烧不充分时产生，是一种无色无味、不溶于水的有毒气体[1]。由于一氧化碳与血红蛋白结合能力强于氧气，故人体在吸入一氧化碳后，会部分失去携氧能力，造成身体缺氧而中毒。一氧化碳中毒的程度决定于血液中碳氧血红蛋白的饱和程度，机体对一氧化碳的耐受性有很大差异，甚至同时中毒者可表现出不同程度的症状。由于我国北方冬季取暖期较长，屋内生活取暖时煤层等燃料不完全燃烧，造成中毒案事件时有发生。

硝酸盐和亚硝酸盐是自然界中最普遍的含氮化合物，广泛存在于人们日常生活环境中。人体内硝酸盐在微生物的作用下可还原为亚硝酸盐、N-亚硝基化合物的前体物质。由于常见亚硝酸盐外观及味道都与食用盐相似，多年来，常有误将亚硝酸盐当作食用盐、白砂糖、食用碱等使用而中毒的案事件。我国北方各省群众在漫长的冬季有食用腌菜等腌制品的习惯，而许多蔬菜，如小白菜等能从土壤中富集硝酸盐。当以这些蔬菜为原料腌制或保存不好腐烂变质及长时间温水焖煮时，在大肠杆菌、沙门氏菌等硝酸盐还原菌作用下，蔬菜中富集的硝酸盐转化为亚硝酸盐；有的地方会直接使用亚硝酸盐含量较高的苦井水腌制食品。食品工业中也允许亚硝酸盐作为防腐剂限量使用[2]，不法商家用亚硝酸钠拌肉馅冒充纯瘦肉掩盖肥肉色泽[3]。过量进食含亚硝酸盐较多的食物或食用了腐烂变质的蔬菜、肉制品，造成亚硝酸盐中毒案事件也常有发生。

在北方漫长的冬季，多地群众有生火取暖及食用腌菜的习惯，使得一氧化碳与亚硝酸盐共存的机会增大，在多起案事件现场中均发现了同时出现腌制食品和一氧化碳的情况，亚硝酸盐能阻止正常氧合血红蛋白释放氧气，使组织出现缺氧现象[4]，一氧化碳也会造成组织缺氧，由于很多现场毒物浓度低，尸体征象不明显，利用尸表判断此类案事件真实的中毒原因存在困难。同时由于亚硝酸盐的存在会对广泛使用的氨水法测定碳氧血红蛋白的准确性产生影响，导致检测结果不准确，对案事件的性质准确判定也产生较大困扰。

针对此类问题，本文考察了亚硝酸盐对氨水法测定碳氧血红蛋白含量的影响并探究机理，为食源性亚硝酸盐及碳氧血红蛋白相关的中毒案事件提供中毒原因分析的科学依据，为此类案事件的定性以及检验鉴定工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

Agilent Cary 5000紫外-近红外-可见分光光度计（美国Agilent Technologies）；Brand Transferpette移液器（德国Brand）；亚硝酸钠（分析纯，中国光复试剂），氨水（色谱纯，中国科密欧试剂），超纯水，一氧化碳中毒者血样及阴性血样（来自于实际案件）。

1.2 原理

碳氧血红蛋白与氧合血红蛋白对光谱有不同的特征吸收，氧合血红蛋白在589～577 nm、556～536 nm区间有两条吸收谱带，其中于579、542 nm处有最大吸收，碳氧血红蛋白在579～564 nm、548～530 nm区间有两条吸收谱带，其中于572、539 nm处有最大吸收[5]。用0.5%的氨水稀释后的一氧化碳中毒案件检材血在529、582 nm处有吸收峰，稀释液做参比，利用经验公式测定含量：

1.3 前处理与方法

保持环境恒温[6]，取混匀后的检材血少许，充分溶于0.5%的氨水中，并使溶液在529、582 nm处的吸光度始终处于0.4～0.6之间，备检。

实验一：选取多组由阴性及不同含量碳氧血红蛋白检材血样组成的系列，系列中各检材血样平行测定三组后得其碳氧血红蛋白含量均值。

实验二：分别向实验一中检材血样中加入不同浓度的亚硝酸钠，使其含量分别为0.05、0.1、0.2 mg/mL （口服亚硝酸盐1～2 g可致死[5]，根据一般身材成年人体内血液容量换算亚硝酸钠中毒致死时血液浓度约为0.2～0.25 mg/mL）后按照氨水法进行碳氧血红蛋白定性定量测定。

实验三：对实验二中测定所得数据进行分析后再选取不同含量碳氧血红蛋白检材血样组成的系列，每份血样取2 mL，分别加入亚硝酸钠后混匀，使其中亚硝酸钠浓度为0.25 mg/mL（以70 kg体重人体为准，致死血液浓度约为0.25 mg/mL）后仍然正常进行氨水法的碳氧血红蛋白定性定量测定。

2 结果与讨论

2.1 结果

由图1可以看出，阴性检材血样谱图中529 nm处吸光度（碳氧血红蛋白量）低于582 nm处吸光度（氧合血红蛋白量），经过经验公式计算后结果为负值，即阴性结果；阳性检血谱图中529 nm处吸光度高于582 nm处吸光度，即阳性结果，并经过经验公式可准确计算结果；应为负值的阴性检血加入亚硝酸钠后谱图中529 nm处吸光度明显高于582 nm处吸光度，经过经验公式计算后结果为正值，即出现假阳性结果。

由图2可以发现，添加了不同量亚硝酸钠的阴性检材血样，其582 nm处吸光度即氧合血红蛋白量会随着亚硝酸钠的量增大而同步降低，其吸光度会逐步低于529 nm处碳氧血红蛋白吸光度。此时无论是谱图，还是经过计算，结果均趋同于碳氧血红蛋白血谱图，结果也为正值，且该值随着亚硝酸钠量的增加而增大，即会出现假阳性的结果。经过对多个（n＞100）来自不同个体的检材血样的实验测定，由于个体差异的原因，虽然假阳性的定量值与亚硝酸钠的含量在一定范围内存在正相趋同，但是能够引起假阳性的亚硝酸钠的含量及亚硝酸钠增大到碳氧血红蛋白定量值不再增大时的含量，各不相同，并未显示有较为明显的阈值。

对于阳性检材血样的影响，由图3可以发现，也具有与阴性检材血样相同的影响趋势，同样由于个体差异的原因，产生影响的亚硝酸钠的量未发现有明显的阈值。

图1 阴性、阳性及假阳性碳氧血红蛋白光谱图Fig. 1 Carboxyhemoglobin’s spectra shown as the negative, positive and false positive conditions

图2 阴性及添加不同含量亚硝酸钠后假阳性碳氧血红蛋白 光谱图Fig. 2 Carboxyhemoglobin’s spectra shown as the negative and false positive with addition of content-different sodium nitrite

图3 阳性及添加不同含量亚硝酸钠后碳氧血红蛋白光谱图（HbCO%＝45.9%）Fig. 3 Carboxyhemoglobin’s spectra shown as the normal positive and positive with addition of content-different sodium nitrite (HbCO%=45.9%)

选择添加致死量的亚硝酸钠的检材血样，经过多组不同系列浓度重复测定后，选取的各系列浓度检材血样碳氧血红蛋白含量实际值及经亚硝酸盐干扰后的值如表1所示。

表1 碳氧血红蛋白含量测定结果Table 1 Contents of carboxyhemoglobin determined

由以上结果可以得出：

1）用氨水法进行测定时，血液中一定浓度亚硝酸盐的存在可导致不含碳氧血红蛋白的正常血在碳氧血红蛋白测定时结果为阳性，即阴性血被误判为阳性；虽以致死量上限作为添加量进行了验证，但经过实验可知：血液中不同含量的亚硝酸盐浓度对这种假阳性的影响程度不同，且个体差异较大。经过抽样测定（n＞100），总体来说，呈现的规律为：极低浓度的亚硝酸盐并不会导致假阳性，而能够导致中毒的亚硝酸盐浓度则一定会在测定时出现碳氧血红蛋白测定假阳性；假阳性的定量值也受到亚硝酸盐浓度的影响，呈现正相关关系，但由于个体差异的不同，并未发现有具体的量化趋势。

2）用氨水法进行测定时，血液中亚硝酸盐的存在会导致碳氧血红蛋白含量较低的检材血样中所测得的碳氧血红蛋白含量显著增大，增大后的含量接近50%，而碳氧血红蛋白含量较高的血样中碳氧血红蛋白含量测定值则改变较为轻微，并有略微降低的情况出现，如图4所示。

图4 加入亚硝酸钠后碳氧血红蛋白测定值变化图Fig. 4 The changing values of determined carboxyhemoglobin with addition of sodium nitrite

2.2 讨论

血液中一定量亚硝酸盐的存在将导致氨水法测定碳氧血红蛋白时出现假阳性或低含量阳性检材血样中碳氧血红蛋白含量测定值增大，增大原因为氨水法测定碳氧血红蛋白含量时是以529 nm波长处碳氧血红蛋白的吸光度减去582 nm处氧合血红蛋白的吸光度进行计算。而亚硝酸盐存在时，在其作用下氧合血红蛋白含量会减少，造成582 nm处吸光度降低，从而出现假阳性或测定值增大的结果。然而高含量阳性检材由于碳氧血红蛋白含量较高，中毒剂量的亚硝酸盐虽然可以使其中氧合血红蛋白的含量减少，但减少的幅度并不足以引起碳氧血红蛋白含量测定值的较大变化。

3 结论

本文对血液中亚硝酸盐的存在对氨水法测定碳氧血红蛋白的影响进行研究。通过实验分析，亚硝酸盐的存在会造成碳氧血红蛋白含量测定时出现假阳性或低含量阳性检血中碳氧血红蛋白测定值增大的现象。在实际案件检验中，当阳性碳氧血红蛋白检血中含有较高浓度的亚硝酸盐时，血液自身的颜色会呈现出较为明显的亚硝酸盐中毒所具有的酱油色，虽然会与腐败血有所类似，但仍然较易从颜色上进行区分。然而当亚硝酸盐浓度较低时，对二者的区分则比较困难。此时氨水法作为判定一氧化碳中毒普遍使用的检验方法，在使用时亚硝酸盐可能导致的假阳性及含量增大的情况应引起足够的重视，并主动加以分辨，进一步进行亚硝酸盐的确认与排除，防止误判。同时，在案件检验中，对于现场出现的其他有具有类似性质并可能产生类似影响的物质，在使用该法测定碳氧血红蛋白时也应加以注意，进行分析排除。