氮添加对竹屑堆肥及其栽培大球盖菇的影响

吴一凡，张玮，刘昊林，谢锦忠，陈胜

(中国林业科学研究院 亚热带林业研究所，浙江 杭州，311400)

大球盖菇(Strophariarugoso-annulata)又名赤松茸、皱环球盖菇，是国际菇类交易市场十大菇种之一，同时也是联合国粮农组织(Food and Agriculture Organization,FAO)和世界卫生组织(World Health Organization,WHO)向发展中国家推荐栽培的食用菌之一[1-2]。大球盖菇含有丰富的多糖、蛋白质、氨基酸和矿质元素，且抗逆性强，生物学转换效率高，是较适宜竹林下套种的品种[3]。我国竹资源丰富，竹林生境良好，是套种大球盖菇的优良场所。利用竹林砍伐废弃物粉碎的竹屑或者竹材初加工废弃物能够栽培大球盖菇等食用菌，是解决近年来纯竹林经营效益下滑，竹林弃管问题的有效途径[4]。

目前大球盖菇的栽培方式主要以发酵料栽培为主[5]，将适宜食用菌栽培的碳源和氮源按合理的配比堆制发酵栽培食用菌，具有污染小、成本低、工艺简单和经济效益高的优点[6]。已有研究表明，氮添加是影响培养料发酵和食用菌生长发育的关键，培养料的含氮量直接影响了食用菌的产量与品质[7]。竹屑富含纤维素和木质素，是栽培食用菌的优良碳源，麦麸富含蛋白质，是优良的有机氮源，培养料添加麦麸能提高大球盖菇菌丝的长势与生长速度[8]。目前针对氮添加对木屑发酵栽培金针菇、鸡腿菇、猪肚菇等食用菌产量与营养品质的影响已有充分报道[9-10]，但氮添加对竹屑发酵及其栽培食用菌的品质影响的研究还十分缺乏。为此，本研究以竹屑作为主要栽培基质，以麦麸作为氮素补充，测定不同氮添加量下竹屑发酵前后的理化性质，及其栽培大球盖菇的菌丝生长、生物学效率、营养品质和重金属残留情况，探究氮添加对竹屑发酵及其栽培大球盖菇的影响，确定竹屑发酵及其栽培大球盖菇适宜的氮添加量。为大球盖菇的栽培推广提供理论依据，也为竹林经营与竹材废弃物的资源化利用提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试验样地

供试大球盖菇母种购于福建省永安市西南真菌研究所，栽培种由中国林业科学研究院亚热带林业研究所自主扩繁。竹屑购自杭州市富阳区，为毛竹(Phyllostachysheterocycla)粗加工下脚料，含氮量为2.6 g/kg，麦麸购于河南省永城市，含氮量为25.3 g/kg。

试验样地位于浙江省杭州市富阳区中国林业科学研究院亚热带林业研究所(30°06′N，119°96′E)，属亚热带季风性气候，极端低温-9 ℃，试验地海拔120 m，坡向朝西，坡度约15°，郁闭度0.7，土壤为黄壤。

1.2 试验设计

试验设计4种氮量添加竹屑栽培基料，按质量配比分别为：100%纯竹屑，96%竹屑+4%麦麸(T1)，92%竹屑+8%麦麸(T2)，84%竹屑+16%麦麸(T3)。各栽培料添加0.5%石灰后拌匀补水至含水量70%，置于内径67.5 cm×48 cm×41 cm的泡沫箱内进行高温发酵40 d，每10 d进行1次翻堆。基质发酵结束后，打开泡沫箱盖透气3 d。发酵前后取堆体中间层鲜样，测定容重和孔隙度，并在26 ℃恒温组培室内测定不同基质栽培大球盖菇的菌丝生长速度和菌丝长势。部分样品风干、磨细、过40目筛后用于pH、电导率(electrical conductiity,EC)、全氮和有机碳的测定。

2020年8月25日，选取立地条件和经营水平基本一致的试验样地进行林下种植穴套种，每个种植穴直径30 cm，穴间距20 cm，每个种植穴内播4 kg发酵料和200 g大球盖菇栽培种，每个处理5个重复。2020年11月～2021年3月以种植穴为单元进行采收，统计各单元的鲜菇产量与出菇时间。清理菇表面的泥土与杂物后将鲜菇的菇盖与菇柄分开，分别粉碎、匀浆用于蛋白质、可溶性糖、多糖、总酚和金属离子的测定，并取部分鲜样对半切开于105 ℃的烘箱中烘至恒重测定其含水率。

1.3 测定方法

1.3.1 竹屑发酵后理化性质的测定

竹屑的容重、孔隙度采用环刀法测定。将(样品)∶(蒸馏水)=1∶5混合，再经振荡后用电导率仪测定EC值，测定pH值。全氮采用半微量凯氏法测定，有机碳采用重铬酸钾容量法测定。

1.3.2 菌丝生长速度与生物学效率的测定

取各处理的等量发酵竹屑分别置于内径12 cm，高10 cm的培养瓶中，每瓶接种2 g大球盖菇原种后置于26 ℃恒温组培室培养。待菌丝萌动后，每天观察记载菌丝生长速度及长势，试验设3次重复。

出菇期间，当菌盖未展开呈钟型时，对每个种植穴的大球盖菇进行采收称质量，生物学效率按公式(1)计算：

(1)

1.3.3 大球盖菇营养品质的测定

大球盖菇的粗蛋白测定参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》第一法；可溶性糖测定参照NY/T 1278—2007《蔬菜及其制品中可溶性糖的测定 铜还原碘量法》；多糖测定参照《中国药典》；总酚测定参照T/AHFIA 005—2018《植物提取物及其制品中总多酚含量的测定 分光光度法》；硒、镉、铅、汞和砷测定参照GB 5009.268—2016《食品安全国家标准 食品中多元素的测定》中的电感耦合等离子体质谱法；锌和钙测定参照GB 5009.268—2016《食品安全国家标准 食品中多元素的测定》中的电感耦合等离子体发射光谱法。

1.4 数据处理

试验数据在Excel 2020和Origin 2019中进行整理和图表制作，在SPSS 21.0中对数据进行分析处理，主成分评价时将有害元素(汞、镉、铅、砷)指标取倒数进行正向化处理。试验数据显著性水平为P<0.05，不同小写字母表示差异性显著。

2 结果与分析

2.1 氮添加对竹屑堆肥理化性质的影响

如表1所示，T1、T2、T3处理发酵后竹屑培养料的容重、EC值显著增大，孔隙度、pH显著减小，对照组在发酵前后无显著差异。随着氮添加量的增加，发酵后竹屑培养料的EC显著增加。T1、T2和T3处理的容重显著高于CK，它们之间无显著差异。T1和T2处理的孔隙度显著低于CK和T3处理。可见，适宜的氮添加会促进竹屑发酵腐熟，改善竹屑的理化性质，适宜大球盖菇栽培。

表1 各处理基质发酵前后理化性质Table 1 Physicochemical properties of substrates before and after fermentation

2.2 氮添加对竹屑栽培大球盖菇生长的影响

如表2所示，随着氮添加的增加，竹屑栽培大球盖菇的菌丝生长速度呈现降低的趋势，生长速度最高的T1处理与对照组之间无显著差异，均显著高于其他处理。菌丝长势以T2处理为最佳，菌丝洁白粗壮且浓密。T1和T2处理之间的生物学效率无显著差异，但均显著高于其他处理，达到了84.25%和86.66%。可见，纯竹屑栽培大球盖菇菌丝生长速度快，但菌丝纤细且生物学效率低，一定的氮添加可以提高竹屑栽培大球盖菇的生长势，但过多的氮添加也会产生抑制作用。

表2 氮添加对大球盖菇的生长指标的影响Table 2 Growth indexes of S. rugoso-annulata cultiated with nitrogen additions

2.3 氮添加对竹屑栽培大球盖菇营养品质的影响

如表3所示，各处理菇柄的含水率均显著高于菇盖，蛋白质、多糖、锌、硒在菇盖中含量显著高于菇柄，总酚在菇盖与菇柄之间无显著差异。CK组菇盖的可溶性糖显著高于菇柄，T2处理菇盖的钙显著高于菇柄，其他处理均呈现菇盖高于菇柄的趋势，但未达到显著水平。随着氮添加量的增加，大球盖菇中蛋白质含量也随之增加，T3处理菇柄和菇盖的蛋白质含量最高，达到了1.89%和4.11%，显著高于其他处理。含水率和总酚在各处理之间无显著差异，可溶性糖和多糖随着氮添加量的增加分别有减少和增加的趋势，但均未达到显著水平。含量硒随着氮添加量的增加呈“”型趋势。各处理中，T2处理菇盖的钙显著高于其他处理，但菇柄的钙在各处理间无显著差异。可见，氮添加对竹屑栽培大球盖菇的不同营养指标有不同的影响。

表3 氮添加对栽培大球盖菇的营养品质的影响Table 3 Nutritional compositions of S. rugoso-annulata cultiated with nitrogen additions

2.4 氮添加对竹屑栽培大球盖菇重金属含量的影响

由图1可知，大球盖菇各处理菇盖的镉含量均显著高于菇柄，CK和T3处理菇盖的汞含量显著高于菇柄，CK和T2处理菇盖的铅含量显著高于菇柄，CK组菇盖的砷含量显著高于菇柄。随着氮添加量的增加，各处理间汞和镉的含量呈“”型趋势，T1和T2处理显著低于其他处理；各处理间铅含量无显著差异；砷含量呈现下降的趋势，CK组菇盖显著高于其他处理，但T1、T2、T3处理间无显著差异。

a-汞；b-镉；c-铅；d-砷图1 大球盖菇重金属的含量特征Fig.1 Content characteristics of heay metals in S. rugoso-annulata 注：不同小写字母代表差异显著(下同)

食用菌鲜品中的汞、镉、铅和砷的含量上限分别为0.1、0.5、1.0、0.5 mg/kg，对照组和T3处理的汞含量分别为0.133和0.104 mg/kg，超出国家食品安全限量。T2处理菇盖的镉含量最低，为0.49 mg/kg，接近安全限量临界值，其他各处理菇盖的镉含量均超出国家食品安全限量，说明样地大球盖菇存在汞和镉超标的风险。铅和砷的残留均在国家食品安全标准范围内。T2处理菌盖和菌柄的各项重金属残留均为最低，食用菌的安全品质较好。

2.5 氮添加对竹屑栽培大球盖菇的主成分评价

将4个处理菇柄和菇盖的7个营养品质指标和4个重金属残留指标经过主成分分析(principal component analysis，PCA)提取，第1、2、3个主成分的累积方差贡献率达到了88.45%，可基本反映4个处理菇柄和菇盖成分指标的大部分信息。第一主成分与汞的倒数高度正相关，第二主成分与钙和可溶性糖高度正相关，第三主成分与多糖和总酚高度正相关。可见，钙、汞的倒数、多糖、可溶性糖和总酚是评价大球盖菇综合品质的重要指标。可得大球盖菇综合品质得分计算公式如下：

F1=-0.048×ω(蛋白质)+0.183×ω(钙)+0.376×ω(硒)+0.035×ω(锌)+0.07/ω(砷)+0.212/ω(镉)+0.157/ω(铅)+0.435/ω(汞)+0.069/ω(多糖)+0.118×ω(总酚)+0.153×ω(可溶性糖)

F2=0.036×ω(蛋白质)+0.527×ω(钙)-0.148×ω(硒)+0.117×ω(锌)-0.18/ω(砷)-0.053/ω(镉)-0.131/ω(铅)+0.243/ω(汞)-0.045×ω(多糖)-0.246×ω(总酚)+0.34×ω(可溶性糖)

F3=0.174×ω(蛋白质)-0.239×ω(钙)-0.082×ω(硒)+0.163×ω(锌)+0.055/ω(砷)+0.072/ω(镉)+0.097/ω(铅)+0.061/ω(汞)+0.385×ω(多糖)+0.623×ω(总酚)-0.014×ω(可溶性糖)

FZ=32.501%×F1+29.966%×F2+23.078%×F3

大球盖菇综合品质得分结果表明(表4)，各处理菇盖与菇柄之间综合品质无显著差异。随着氮添加量的增加，各处理的综合品质呈现倒“”型趋势，对照组的综合品质评分最低，T2处理的大球盖菇综合品质表现最好。

表4 大球盖菇综合因子得分Table 4 S. rugoso-annulata comprehensie factor score

2.6 培养料理化性质与大球盖菇品质的相关性分析

由图2可知，氮添加与EC、多糖、锌、蛋白质呈显著正相关，与菌丝生长速度、可溶性糖呈显著负相关。生物学效率与汞、镉、硒、砷呈显著负相关，与钙呈显著正相关。菌丝生长速度和EC、容重呈显著负相关。镉、汞、铅、硒、砷5种矿质元素之间均呈显著正相关。多糖和可溶性糖呈显著负相关。

图2 生物学效率与各营养成分的相关性分析Fig.2 Correlation analysis between biological conersion rate and nutrients

3 结论与讨论

对竹屑进行适量的氮添加可以改善竹屑的理化性质，提升大球盖菇的生物学效率与营养品质。培养料发酵后的理化性质直接决定着食用菌的生长发育。本研究中，竹屑经堆制发酵后，培养料的EC和容重增加，孔隙度、pH和C/N减小,这是因为竹屑经堆制发酵，有机物矿化，形成了可溶性盐和有机酸[11]。

氮添加与大球盖菇的生长与品质密切相关，T1和T2处理的配方均优于前人的结果[12]。纯竹屑缺少大球盖菇生长所需的氮，导致其生物学效率较低，生物学效率与氮添加呈倒“”型趋势。随着氮添加量的增加，培养料的容重和EC增加，大球盖菇的生长速度降低，菌丝生长速度和培养料的EC、容重显著负相关，这说明培养料的容重和盐分过高会抑制大球盖菇生长。培养料的C/N是影响食用菌生长的关键因素，T2和T3处理的终止碳氮比相近，但最高氮添加量的T3处理的竹屑发酵前后C/N降低幅度小，菌丝生长速度、菌丝长势和生物学效率低，可能是因为氮添加过多产生过量的氨气，会对微生物活动不利，导致竹屑未完全腐熟[13]，从而影响大球盖菇的生长。

大球盖菇子实体营养丰富，各处理菇盖的蛋白质、多糖和矿质元素均显著高于菇柄，这可能是因为菇盖负责食用菌孢子的生殖发育，其营养富集能力较菇柄更强。总酚在各处理之间，菇盖和菇柄之间均无显著差异，这可能是因为酚类物质不参与食用菌的生殖发育，且酚类物质主要由碳氢氧构成，氮添加并不影响其合成。氮素是蛋白质重要的组成部分，大球盖菇的蛋白质随着氮添加量的增加而显著增加。但可溶性糖和多糖分别呈现下降和上升的趋势，可溶性糖和多糖呈显著负相关，这可能是因为食用菌细胞壁内广泛存在的几丁质属于含氮多糖[14]，氮添加会促使大球盖菇中可溶性的氨基葡萄糖向其转化。

硒是人体必须的微量元素之一，有较强的抗氧化活性[15]，竹子相对于其他树木具有更强的硒富集能力，食用菌对硒也具有较强的生物富集与转化能力[16]，本研究大球盖菇中的硒含量均在安全限值内达到了富硒食品(0.02 mg/kg)的标准，说明竹屑栽培大球盖菇可以作为良好的富硒农产品生产途径进行推广。钙是信号传导的关键元素、酶的活化剂，在食用菌孢子的形成中起重要作用[17]。T2处理菇盖的钙含量显著高于菇柄，菇盖钙含量在各处理中最高，菇柄钙含量最低，富集系数达到了221%，生物学效率和钙呈显著正相关。这可能是因为培养料添加石灰后钙元素较富足，菌丝生长势最优、生物学效率最高的T2处理具有更强的富集能力。

大球盖菇虽然营养成分丰富，但其含有的金属硫蛋白对重金属也有较强的富集特性[18]，其子实体中重金属等危害物质超标风险也是食品质量安全的关键问题[19]。本研究中，样地大球盖菇存在汞和镉超标的风险，而其生物学效率和重金属残留显著负相关，说明竹屑栽培大球盖菇的蛋白质和重金属主要来自于竹屑培养料，这可能是因为食用菌的富集作用。应避免采用重金属残留较高的培养料，或采用蚯蚓堆肥和添加石膏等措施来防控食用菌重金属污染[20-21]。T2处理的大球盖菇各项重金属残留均未超标，符合国家食品安全限量标准。通过PCA对多个指标进行综合性评价[22]，得出T2处理的综合品质最佳。

综上，竹屑栽培大球盖菇时，进行一定的氮添加，采用T2处理配方(92%竹屑+8%麦麸)，调节培养料初始碳氮比为100，堆制发酵后进行栽培，虽然生长速度有所延缓，但可以显著提高其生物学效率和综合品质，避免重金属残留超标的风险。