河南焦作地区肉种鸡场沙门菌的分离鉴定及耐药性分析

杜海霞 ， 朱平军 ， 娄福丽 ， 王梦艳

(1.周口职业技术学院 , 河南 周口 466000 ； 2.商水县动物卫生监督所 , 河南 周口 466000 ；3.河南省焦作市温县农林局 , 河南 焦作 454850)

鸡沙门菌病是危害鸡养殖业较严重的疾病之一，也是临床中常见的细菌性疾病。可感染鸡的沙门菌主要有鸡白痢沙门菌、鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌等多种血清型，其中鸡白痢沙门菌对幼雏危害较大，其发病率和死亡率均较高，可引起产蛋鸡的产蛋率下降，该菌可以通过多种途径传播，也可垂直传播给子代，人食用被沙门菌污染的食品，可引发食物性中毒和食源性疾病，该菌不仅给养鸡业带来重大损失，同时也严重威胁公共卫生安全[1-5]。目前，在临床中鸡沙门菌血清型众多，传播方式多样，没有有效疫苗可以预防，主要依靠抗菌药进行治疗与预防，随着抗菌药物的不合理使用，导致出现耐药性及药物残留等一系列问题，尤其是残留药物可以通过多种途径传播给人类，对人类的健康造成潜在的威胁，同时由于耐药性的产生，给临床中沙门菌病的治疗带来更多的困难[6-7]。因此，临床中应该对鸡沙门菌病进行净化，减少该病的发生与流行，同时开发替抗添加剂具有重要的意义。本试验于2017—2019年采集肉种鸡场疑似沙门菌病例的组织、死胚和病死雏鸡等病料组织572份，进行沙门菌分离鉴定并检测其耐药性，为该地区的肉种鸡场沙门菌的综合防控和科学使用抗菌药物提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源 2017—2019年采集焦作地区肉种鸡场中疑似沙门菌病例的组织、死胚和病死雏鸡等病料组织572份。

1.2 主要试剂 沙门菌显色鉴定培养基、蛋白胨水、沙门菌增菌液(TTB)、营养肉汤，均购自上海康朗生物科技有限公司；临床中常用的16种抗菌药药敏纸片，购自杭州华康微生物试剂有限公司；2×TaqMaster Mix，购自北京康为世纪生物科技有限公司；DL-2 000 DNA Marker，购自北京中科瑞泰科技有限公司；沙门菌生化鉴定试纸条，购自青岛海博生物科技有限公司。

1.3 细菌分离与鉴定 将采集的样品进行无菌处理后，接种于沙门菌增菌液(TTB)，37 ℃、200 r/min振荡培养8～12 h增菌后，在无菌条件下，取增菌液50 μL均匀接种于沙门菌显色鉴定培养基，37 ℃恒温条件下进行鉴别培养12～18 h，挑取沙门菌显色鉴定培养基单个菌落进行纯化培养，取纯化培养的分离菌株进行染色镜检观察其形态，按照沙门菌生化鉴定试纸条说明书对分离的纯化培养的菌株进行生化特性鉴定。

1.4 细菌PCR鉴定 对生化鉴定为沙门菌的菌株，采用水煮法提取分离菌株的基因组DNA，进行PCR鉴定。根据GenBank中沙门菌基因序列，参照参考文献[8]设计沙门菌保守区引物invA(F:5′-ACAGTGCTCGTTTACGACCTGAAT-3′；R:5′-AGAC-GACTGGTACTGATCGATAAT-3′),引物invA序列由深圳华大基因股份有限公司合成。沙门菌鉴定基因invA引物扩增片段的大小为241 bp，以提取的疑似沙门菌株的基因组DNA为模板，用鉴定引物invA进行PCR鉴定，挑取PCR检测阳性的样品进行测序，其测序结果与GenBank中公布的沙门菌序列进行同源性比对。

1.5 药敏试验 对临床中分离获得的沙门菌，参照美国临床检验标准委员会(NCCLS)推荐的标准K-B纸片法进行药敏试验和结果判断[敏感(S)、中介(I)或耐药(R)],并分析分离菌株的耐药性。

1.6 耐药基因检测 根据GenBank中公布沙门菌的耐药基因序列，参照参考文献[9-10]，用Primer 5.0设计耐药基因引物，并由深圳华大基因股份有限公司合成。检测的耐药基因包括：β-内酰胺类耐药基因(tem、cmy、shv)，磺胺类耐药基因(Sul1、Sul2、Sul3)，氨基糖苷类耐药基因[aac(3)-Iv、aac(6′)-Ib]，喹诺酮类耐药基因(gyrA、gyrB、qurS)，四环素类耐药基因(TetA、TetM、TetR)，酰胺醇类耐药基因(floR)，多肽类耐药基因(mcr-1)。以1.4中提取的基因组DNA为模板对上述7类耐药基因进行PCR扩增。

2 结果

2.1 细菌的分离与鉴定 在死胚和病死雏鸡等病料组织分离得到的菌株，在沙门菌显色鉴别培养基上长出大小一致、边缘整齐、蓝紫色的圆形菌落；对疑似沙门菌的菌株进行染色镜检，可见分离菌株呈现无荚膜、两端钝圆的阴性短杆菌；通过生化鉴定，分离的109株细菌均鉴定为沙门菌。

2.2 细菌PCR鉴定 用沙门菌鉴定引物invA对临床分离的109株疑似沙门菌菌株进行PCR鉴定。结果显示，从572份病料组织中分离得到109株沙门菌均可扩增出大小约为241 bp的目的条带(图1)。通过对菌株测序分析，临床分离的109株沙门菌测序结果与GenBank中公布的参考株同源性介于97.9%～99.6%。表明分离的109株细菌从分子生物水平鉴定为沙门菌。

图1 细菌PCR鉴定Fig.1 PCR identification of bacteriaM:DL-2 000 DNA相对分子质量标准； 1:空白对照； 2～9:分离菌株M:DL-2 000 DNA Marker; 1:Blank control; 2-9:Isolated strains

2.3 药敏试验 结果如表1所示，分离的109株沙门菌对阿莫西林、氨苄西林、庆大霉素、新霉素、大观霉素、多西环素、土霉素、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺噁唑啉、氟苯尼考、多黏菌素共12种抗菌药耐药性较严重，耐药率介于51.4%～100.0%；对头孢噻呋、氧氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星4种药物耐药率较低，耐药率介于11.0%～38.5%。由表2可知，临床分离的109株沙门菌呈现多重耐药性，分离菌株以耐12、11、10种药物最多，分别占分离菌株总数的16.5%、17.4%和15.6%，说明该地区分离的沙门菌耐药性严重。

表1 耐药性检测结果Table 1 Results of drug resistance test (n=109)

表2 多重耐药性检测结果Table 2 Results of multidrug resistance test

2.4 耐药基因检测 采用PCR方法对临床中分离的109株沙门菌进行16种耐药基因检测。结果如表3所示，分离的109株沙门菌携带多种基因，其携带的耐药基因Sul1、Sul2、Sul3、aac(3)-Iv、aac(6′)-Ib、TetA、TetM、TetR、floR、mcr-1检出率介于51.4%～93.5%；耐药基因tem、cmy、shv、gyrA、gyrB、qurS检出率介于2.8%～33.0%。

表3 耐药基因检测结果Table 3 Results of drug resistance gene detection (n=109)

3 讨论

禽类是沙门菌的携带者、传播者及主要的感染宿主，沙门菌可以在不同禽类养殖过程中广泛传播，且传播方式多样，既能水平传播，又能垂直传播，尤其是种鸡(种母鸡)携带的沙门菌可通过卵传播给下一代，也可以通过其他途径传染给其他健康鸡，导致沙门菌在禽类养殖中广泛流行[2-4]。沙门菌具有多种血清型且具有地区性，给疫苗研制带来一定困难，也导致该菌在禽类养殖过程中广泛流行[4-7]。本试验于2017—2019年采集焦作地区肉种鸡场中疑似沙门菌病例的组织、死胚和病死雏鸡等病料组织572份，从中分离得到109株沙门菌，说明该地区的肉种鸡场中沙门菌感染严重，存在潜在威胁。因此，对沙门菌进行净化和防控具有重要的意义。

国内许多研究表明，从养鸡场中分离的沙门菌具有很强的耐药性，呈现多重耐药性。羊扬等[6]研究表明，从广西钦州地区采集的麻鸡死胚分离得到164株沙门菌，其对磺胺异噁唑、四环素等抗菌药耐药性严重。吴晓君等[8]研究表明，从华东地区养鸡场中分离的沙门菌对红霉素、阿奇霉素、克林霉素等8种抗菌药的耐药率均超过50%。晏玲等[9]研究表明，从广东黄羽肉种鸡场死胚中分离的鸡白痢沙门菌对磺胺异噁唑、萘啶酸、氨苄西林、四环素耐药率均较高，且均呈现多重耐药性。本试验显示，分离的109株沙门菌对常用的抗菌药均产生很强的耐药性。说明沙门菌耐药性普遍存在，应该引起重视，注意抗菌药的合理使用。沙门菌耐药性的产生不仅与外界抗菌药的使用有关，还与携带的耐药基因有关，耐药基因可以通过多种途径在动物和人类之间传播，不仅导致耐药性的产生，还对人类健康造成隐患[10-11]。姜梦等[12]研究表明，从昆明某鸡场分离的沙门菌携带多耐药基因型。本试验结果显示，分离的109株沙门菌携带多种耐药基因，携带耐药基因型是否是引起耐药性产生的主要因素，有待进一步研究。本试验为该地区的肉种鸡场沙门菌的防控提供了科学依据。