miRNA-451和钙结合蛋白39在非小细胞肺癌患者中的表达及临床意义

程涛，李卫阳，马程远

南阳市第一人民医院呼吸与危重症医学科，河南 南阳 473000

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌中常见的类型，约占所有肺癌的80%[1]。目前NSCLC的治疗已经有了重大进展，但患者预后仍然不是十分理想，这主要是因为NSCLC早期症状比较隐匿，很多患者确诊时已发展至晚期，同时还伴随淋巴结转移[2]。因此，早期诊断NSCLC十分重要。近年来的研究发现，微小RNA（microRAN，miRNA）是转录后的一种调控因子，会抑制靶基因表达，参与各种疾病的发生发展过程。miRNA作为肿瘤抑制因子，有助于判定肿瘤患者预后[3]。钙结合蛋白39（calcium binding protein 39，CAB39）是从黑斑息肉综合征患者组织中分离得到的，目前已在前列腺癌和肝癌中证实其可作为一种新的生物标志物。本研究通过检测miRNA-451和CAB39在NSCLC患 者NSCLC组 织及癌旁组织中的表达情况，分析其与患者临床特征的关系，并探讨miRNA-451和CAB39的表达对NSCLC患者预后的影响，以期为NSCLC患者的早期诊断提供理论依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年1月至2017年1月南阳市第一人民医院收治的NSCLC患者。纳入标准：①经病理检查确诊为NSCLC，且术前未接受放疗、化疗等治疗；②经影像学检查，临床分期明确；③免疫组化染色效果好；④临床资料完整。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②合并心、肝、脾等器质性疾病。根据纳入和排除标准，本研究共纳入180例NSCLC患者。其中，男93例，女87例；≤60岁122例，＞60岁58例；肿瘤直径：≤3 cm 108例，＞3 cm 72例；肿瘤部位：周围型152例，中央型28例；病理类型：腺癌127例，鳞状细胞癌53例；分化程度：低分化89例，高分化91例；有淋巴结转移106例，无淋巴结转移74例；临床分期：Ⅰ~Ⅱ期117例，Ⅲ~Ⅳ期63例。收集患者的NSCLC组织180例和对应的癌旁组织（距肿瘤边缘5 cm以上）180例。本研究经医院伦理委员会审批通过，所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测miRNA-451相对表达量

取NSCLC组织和癌旁组织，采用二甲苯脱蜡，以100%、90%、80%、70%、50%浓度的乙醇梯度除去二甲苯。采用miRNA提取试剂盒提取miRNA，采用分光光度计对RNA进行定量评估，质量评估采用琼脂糖凝胶电泳，采用TaqMan miRNA逆转录试剂盒合成cDNA，然后以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，操作严格按照试剂盒说明书。反应体系：1 ml cDNA，10 ml 2×PCR Master Mix，1 ml正向引物，1 ml反向引物，0.5 ml 10×SYBER Green，6.5 ml ddH2O。反应条件：95℃10 min，95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，40个循环。以U6为内参，计算miRNA-451的相对表达量。miRNA-451正向引物5'-GATCAAGGGGTTTTGGCTTT-3'，反 向 引 物5'-GTTGTCCATGGGGACCTCTA-3'；U6正向 引物5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，反向引物5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATG-3'。采 用2-ΔΔCt法计算miRNA-451相对表达量，测量3次取平均值。以miRNA-451的中位数为界，＜中位数为低表达，≥中位数为高表达。

1.3 免疫组织化学染色法检测CAB39表达情况

取NSCLC组织和癌旁组织，经福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片贴于3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷处理的载玻片上，采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶（streptavidinperoxidase，SP）法进行免疫组织化学染色，操作严格按照试剂盒说明书，二氨基联苯胺显色，苏木素复染。根据阳性细胞所占比例和染色强度评估染色结果[4]。阳性细胞所占比例评分：＜5%为0分，5%~29%为1分，30%~69%为2分，≥70%为3分；染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，深黄色或棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞所占比例评分和染色强度评分相乘，0~3分为阴性，≥4分为阳性。

1.4 随访方法

采用电话和门诊随访的方式随访3年，末次随访时间为2020年1月31日，统计生存情况。

1.5 统计学分析

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用多因素Logistic回归模型分析NSCLC患 者NSCLC组织 中miRNA-451和CAB39表达情况的影响因素；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，组间比较采用Log-rank检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC组织和癌旁组织中miRNA-451和CAB39表达情况的比较

NSCLC组织中miRNA-451相对表达量和CAB39阳性表达率均明显低于癌旁组织，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 NSCLC组织和癌旁组织中miRNA-451和CAB39表达情况的比较

2.2 NSCLC患 者NSCLC组 织 中miRNA-451和CAB39表达情况影响因素的单因素分析

不同性别、年龄、肿瘤部位、病理类型、分化程度NSCLC患 者NSCLC组 织 中miRNA-451和CAB39表达情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。肿瘤直径＞3 cm、有淋巴结转移、临床分期为Ⅲ~Ⅳ的NSCLC患者NSCLC组织中miRNA-451高表达率均低于肿瘤直径≤3 cm、无淋巴结转移、临床分期为Ⅰ~Ⅱ期的患者，差异均有统计学意义（χ2=5.983、4.217、4.435，P＜0.05）。肿瘤直径＞3 cm、有淋巴结转移、临床分期为Ⅲ~Ⅳ的NSCLC患者NSCLC组织中CAB39阳性表达率分别低于肿瘤直径≤3 cm、无淋巴结转移、临床分期为Ⅰ~Ⅱ期的患 者，差 异 均 有统 计学 意义（χ2=4.916、5.268、17.207，P＜0.05）。（表2）

表2 NSCLC患者NSCLC组织中miRNA-451和CAB39表达情况影响因素的单因素分析

2.3 NSCLC患 者NSCLC组 织 中miRNA-451和CAB39表达情况影响因素的多因素分析

以单因素分析中差异有统计学意义的因素作为自变量，以miRNA-451和CAB39表达情况作为因变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示，淋巴结转移情况、临床分期均是NSCLC患者NSCLC组织中miRNA-451和CAB39表达情况的独立影响因素（P＜0.05）。（表3、表4）

表3 NSCLC患者NSCLC组织中miRNA-451表达情况影响因素的多因素分析

表4 NSCLC患者NSCLC组织中CAB39表达情况影响因素的多因素分析

2.4 生存情况的比较

至随访截止时间，无失访者。miRNA-451低表达患者的中位生存时间为21个月，短于miRNA-451高表达患者的25个月，差异有统计学意义（χ2=8.743，P＜0.05）；CAB39阴性表达患者的中位生存时间为20个月，短于CAB39阳性表达患者的25个月，差异有统计学意义（χ2=14.214，P＜0.05）。（图1、图2）

图1 miRNA-451低表达（n=138）和miRNA-451高表达（n=42）NSCLC患者的生存曲线

图2 CAB39阴性表达（n=115）和CAB39阳性表达（n=65）NSCLC患者的生存曲线

3 讨论

肺癌的发病率和病死率均较高，且呈逐年上升趋势，其中NSCLC是肺癌中最常见的类型之一[5-7]。随着医疗水平的不断提升，NSCLC患者的治疗取得了重大突破，生存时间明显延长[8]。由于早期NSCLC患者的临床症状较为隐匿，不容易被患者察觉，往往在确诊时就已经发展至中晚期，而且此时很多患者还伴随浸润和转移，即使接受手术治疗，其术后复发率也极高[9-10]。目前人们对肺癌发病机制以及细胞增殖、侵袭、迁移等机制认知不足，对患者的早期诊断及预后评估缺乏一定的根据[11-12]。因此，寻找有效的早期诊断及预后指标至关重要。

miRNA-451位于染色体17q11.2，参与肿瘤细胞的增殖、生长、转移等多种生物学行为[13]。目前相关研究证实miRNA-451在膀胱癌、结直肠癌、肝细胞癌中具有抑癌作用，在肿瘤组织中表达下调[14]。CAB39蛋白又称小鼠蛋白25，目前关于其在恶性肿瘤发展中作用的研究较少，相关文献证实CAB39在前列腺癌组织中的表达明显下调[4]。

本研究对180例NSCLC患者的NSCLC组织及癌旁组织进行检测，结果发现，NSCLC组织中miRNA-451相对表达量和CAB39阳性表达率均明显低于癌旁组织，表明miRNA-451和CAB39可能抑制NSCLC的发生。进一步分析miRNA-451、CAB39表达情况与NSCLC患者临床特征的关系，结果表明，miRNA-451、CAB39表达情况与NSCLC患者的肿瘤直径、淋巴结转移情况及临床分期有关，miRNA-451低表达和CAB39阴性有可能会促进肿瘤生长、淋巴结转移，与相关研究结果一致[15-16]。分析原因如下：miRNA能够抑制致癌基因中巨噬细胞游走抑制因子以调节细胞增殖，刺激肿瘤发生增殖、分化、浸润等，而miRNA水平较低时，其调节能力相对较弱，因此肿瘤细胞增殖和转移率较高[17-18]。多因素Logistic回归分析结果显示，淋巴结转移情况、临床分期均是NSCLC患者NSCLC组织中miRNA-451和CAB39表达情况的独立影响因素（P＜0.05）。此外，对180例患者进行随访调查，结果发现，miRNA-451低表达患者的中位生存时间短于miRNA-451高表达患者（P＜0.05），CAB39阴性表达患者的中位生存时间短于CAB39阳性表达患者（P＜0.05）。提示miRNA-451和CAB39对于评估NSCLC患者预后具有一定的应用价值。分析原因如下：miRNA-451可调节耐药基因的表达，从而提高患者药物治疗的敏感性，此外miRNA-451能够抑制肿瘤细胞的增殖和分化等，从而延长NSCLC患者的生存时间[19-20]。

综上所述，NSCLC组织中miRNA-451和CAB39表达水平均明显低于癌旁组织，miRNA-451低表达和CAB39阴性表达均可能会促进肿瘤生长、淋巴结转移，且与NSCLC患者预后有关。但本研究也存在一定的局限性，样本量较少，且为单中心研究，因此未来需要扩大样本量进行多中心研究。此外，目前关于CAB39影响NSCLC患者病情及预后的机制尚不明确，还可加强此方面的研究。