泛素蛋白D、CD133在胃癌组织中的表达及相关性分析

白艳丽，田笑笑，郑玉峰

河南科技大学第一附属医院消化内科，河南 洛阳 471003

胃癌是全球范围内常见的消化道恶性肿瘤之一，发病率和病死率均较高[1]。诱发胃癌发生的因素多种多样，包括饮食因素、幽门螺杆菌感染、遗传因素和癌前病变等，其中基因突变和外在性质改变的积累引起正常组织恶变是公认的胃癌发病原因[2]。肿瘤发生是一个长期的过程，随着干细胞研究的深入，肿瘤干细胞学说为肿瘤的发生发展指明了新的研究方向，该学说的提出使学者意识到鉴别特异性细胞表面标志物的重要临床意义[3]。CD133是一个单拷贝基因产物，由865个氨基酸组成，是五次跨膜结构的糖蛋白。临床研究表明，CD133在胃肠道肿瘤细胞的浸润和转移中具有一定的调控作用，可能与降低肿瘤上皮-上皮间连接、分泌相关因子增加肿瘤细胞穿透细胞外基质的能力等因素有关[4-5]。泛素蛋白首次于1975年被发现，被认为是真核生物蛋白中最保守的蛋白之一，真核生物蛋白可通过与泛素蛋白结合对多种生理过程进行调控[6]。泛素蛋白D（ubiquitin protein D，UBD）被认为是一种致癌基因，已有研究证明UBD对肿瘤的复发和转移有一定的促进作用[7]。本研究通过观察UBD、CD133在胃癌组织中的表达，分析其在胃癌诊断中的临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2019年1月至2021年1月于河南科技大学第一附属医院行手术治疗的胃癌患者的病历资料。纳入标准：①首次发现且未接受过相关治疗；②收治前3个月未服用过抗生素、H2受体拮抗剂等相关药物；③临床资料完整。排除标准：①合并其他胃肠道疾病；②收治前近3个月内进行过胃部或十二指肠手术；③合并其他类型的恶性肿瘤及肝肾功能异常。根据纳入、排除标准，共纳入102例胃癌患者，其中，男61例，女41例；年龄47~65岁，平均（56.76±4.98）岁。收集102例胃癌患者的胃癌组织标本及对应癌旁组织（距离病变部位＞3 cm）标本。本研究经医院伦理委员会批准通过，所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 检测方法

1.2.1 UBD的免疫组化检测 组织切片置于4℃冰箱过夜，并与初级抗体孵育，再置于37℃的环境下与辣根过氧化物二次孵育，时间为30 min，最后使用二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）进行孵育，苏木精复染检测。

1.2.2 CD133的免疫组化检测 试剂为兔抗人PKFD单克隆抗体、兔抗人CD133多克隆抗体、免疫印迹显色剂、DAB显色剂等。所有标本采用4%中性甲醛固定，常规石蜡包埋、切片。取切片脱蜡和水化后，蒸馏水洗3次，每次2 min，后置于3%过氧化氢溶液中10 min，再次蒸馏水洗，以消除内源性过氧化氢酶，使用微波炉进行抗原修复，高火5 min，低火10 min后静置30 min直至冷却，使用磷酸盐缓冲液冲洗3次。蛋白封闭15 min弃血清，滴加稀释好的一抗，置于4℃冰箱过夜，使用磷酸盐缓冲液冲洗后滴加生物素化二抗，孵育30 min，磷酸盐缓冲液再次冲洗后滴加DAB显色液，自来水充分冲洗，复染，盐酸乙醇分化，脱水、透明、封片、镜检。

1.3 结果判定标准

以细胞质或细胞膜呈清晰黄褐色颗粒为阳性细胞，在高倍镜下随机观察5个视野，并根据阳性细胞百分比和染色强度进行半定量分析。UBD阳性细胞百分比计分：＜10%为0分，10%~25%为1分，26%~50%为2分，＞50%为3分；CD133阳性细胞百分比计分：＜5%为0分，5%~24%为1分，25%~49%为2分，50%~75%为3分，＞75%为4分；染色强度计分：无染色为0分，淡黄色染色为1分，棕黄色染色为2分，棕褐色染色为3分。UBD阳性判定：阳性细胞百分比计分与染色强度计分相加，0~1分为阴性，≥2分为阳性；CD133阳性判定：阳性细胞百分比计分与染色强度计分相乘，≥6分为阳性，＜6分为阴性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计数资料以例数及率（%）表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Spearman相关性检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UBD和CD133表达情况的比较

UBD、CD133在胃癌组织中的阳性表达率均明显高于癌旁组织，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 胃癌组织和癌旁组织中UBD和CD133表达情况的比较[n（%）]

2.2 UBD和CD133表达的相关性

Spearman相关性分析结果显示，UBD和CD133在胃癌组织中的表达呈正相关（r=0.613，P＜0.01）。

2.3 不同临床特征胃癌患者胃癌组织中UBD和CD133表达情况的比较

UBD、CD133阳性胃癌患者胃癌组织中肿瘤大小≥5 cm、肿瘤分期为T4b期、分化程度为低分化和有淋巴结转移患者比例均高于UBD、CD133阴性患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

表2 不同临床特征胃癌患者胃癌组织中UBD和CD133表达情况的比较

3 讨论

近年来，随着胃癌的一、二级预防工作的开展，早期胃癌的检出率明显提高，但大部分患者仍处于疾病中晚期。胃癌作为消化系统常见的恶性肿瘤，具有较强的侵袭和转移能力，这也是术后复发和患者死亡的主要原因[8]。因此寻找胃癌发生、发展的标志物是当前研究的重点，及早发现对改善患者预后具有重要临床意义。相关研究指出，肿瘤细胞中部分细胞具有自我更新、分裂和分化能力，研究人员将其称为肿瘤干细胞[9]。肿瘤干细胞理论将肿瘤的发生发展归结为一小部分肿瘤干细胞，肿瘤干细胞是肿瘤不断生长的根源[10]。近年来有研究证实，CD133为肿瘤干细胞的标志物，其在胶质瘤、前列腺癌、乳腺癌等实体瘤中均有表达[11]。CD133主要分布于细胞突部分，在不同的肿瘤组织中表达不同[12]。早期报道称，CD133在结直肠癌伴早期肝转移患者中的表达水平明显高于不伴肝转移患者，因此可将其作为预测预后的有效指标[13]。UBD已被证实为重要的肿瘤调节蛋白，对细胞周期调控、靶蛋白修饰、染色体变异等细胞过程起重要作用[14-15]。UBD可调节细胞有丝分裂，缩短细胞周期，从而促进肿瘤细胞增殖，抑制细胞凋亡[16-17]。已有研究表明，UBD的高表达可介导乳腺癌细胞干性表型改变，从而影响乳腺癌细胞的复发转移[18]。

本研究结果显示，UBD、CD133在胃癌组织中的阳性表达率均明显高于癌旁组织（P＜0.01），据此认为距离肿瘤组织越远，UBD和CD133表达也会随之逐渐减少，进而可通过检测标本边缘确认是否存在肿瘤组织残留，可用于检测手术的有效性。此外还可以通过了解UBD和CD133在癌旁组织中的表达情况判断细胞分化程度，从而分辨肿瘤的良恶性，对指导治疗方案和术后辅助治疗也有重要作用[19-20]。本研究中，Spearman相关性分析结果显示，UBD和CD133在胃癌组织中的表达呈正相关（r=0.613，P＜0.01），但UBD和CD133之间是否存在具体的调节通路，这需要在细胞分子水平进行深入探究。本研究中，UBD、CD133阳性胃癌患者胃癌组织中肿瘤大小≥5 cm、肿瘤分期为T4b期、分化程度为低分化和有淋巴结转移患者比例均高于UBD、CD133阴性患者，这提示胃癌组织中UBD和CD133高表达可能与肿瘤大小、肿瘤分期、分化程度和淋巴结转移存在一定的关系。万晓晨等[21]研究发现，CD133表达与TNM分期和淋巴结转移显著相关，该蛋白及其下游信号通路雷帕霉素靶蛋白高表达对胃癌进展和肿瘤转移具有协调作用，并提示肿瘤具有高度的侵袭和转移潜能，但研究发现CD133表达与肿瘤的分化程度无关，这与本研究存在一定差异。目前关于CD133在胃癌中的研究仍处于起始阶段，Attia等[22]指出CD133可能与肿瘤大小、组织学类型、TNM分期等存在着一定的关系，但这种关系是否具有显著性也受患者的不同特征、遗传学、种族、环境因素及不同评分法的影响，这可能是导致既往研究存在差异的原因。而在临床研究中CD133表达影响胃癌的侵袭和转移能力是较为被认同的，有研究发现CD133可能是介导了转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）诱导的人胃癌细胞中磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）/p70核糖体蛋白S6激酶（p70 ribosomal protein S6 kinase，P70S6K）信号通路的激活，从而促进肿瘤的侵袭和转移[23]。关于UBD在胃癌中的研究报道极少，在Lozano-Pope等[24]研究发现，在幽门螺杆菌感染影响Myd88基因转录谱异常小鼠模型中有1989个基因出现表达差异，包括UBD、鸟苷酸结合蛋白2、CD74等，研究指出这些基因可通过增强血管生成，细胞增殖、迁移、转移和侵袭来促进胃癌进展，这也说明UBD表达与胃癌细胞的增殖、侵袭和转移等具有一定关系，但仍需要更多的临床研究加以证实。由于本研究随访时间短，并不能明确两者的表达水平与预后的关系。

综上所述，胃癌组织中UBD和CD133蛋白表达均高于癌旁组织，两者呈正相关，与肿瘤大小、肿瘤分期、分化程度和淋巴结转移情况均有一定联系，是潜在的预后预测指标。