枯草芽孢杆菌DZSY21 对致病菌生物膜的抑制研究

付春情，薛婉婷，韩旺旺，鲁瞳彤，王海心，陈冠宇，姚沛琳，徐礼生，苏 博

（宿州学院生物与食品工程学院，安徽 宿州 234000）

食品中毒及食品安全问题长期以来备受人们关注，常见致病菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和李斯特菌[1-2]。传统化学防腐剂存在潜在的危害，因此新型天然生物防腐剂的开发已成为食品添加剂发展最热门的方向之一。目前，我国允许使用的2 种天然微生物防腐剂为纳他毒素和乳酸链菌素[3]。然而，乳酸链菌素的抑菌谱较窄，仅对G+细菌有明显的抑制生长作用，不能抑制G-细菌和真菌；纳他毒素能杀死霉菌、酵母菌和丝状真菌，但不能杀死细菌。因此，开发出一种安全、广谱的微生物天然食品防腐保鲜剂具有重要意义[4]。

枯草芽孢杆菌是一种需氧产芽孢的G+细菌，其特性各式各样，广泛存在于自然界中[5]。因其不产生有害毒素，是公认的安全微生物[6]。它通过产生活性抗菌物质发挥生物防治作用，主要包括两类活性抗菌物质：抗菌肽和脂肽类化合物[7]。枯草芽孢杆菌可产生广谱的抗菌活性物质，能明显抑制植物病原菌、致病菌等的生长，抗氧化能力强，是极具研发潜能的微生物天然食品防腐剂和保鲜剂[8-9]。

多数自然界的细菌都可形成生物膜，这是对不利环境的一种保护机制[10]。细菌生物膜是指在相对恶劣的环境下细菌生长过程中形成的一种膜状结构[11]。绝大多数细菌在自然界和人类生活中以生物膜存在，并黏附在各类有机或无机物体表面[12-14]。此外，细菌生物膜耐药性极强，可以在宿主的免疫应答和吞噬作用下保护细菌[15]。因此，研究如何抑制细菌生物膜的形成成为食品及其他学科的要点[16-17]。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 试验菌种

试验菌：枯草芽孢杆菌DZSY21（分离于杜仲叶内）、解淀粉芽孢杆菌FZB42、枯草芽孢杆菌OKB105。

指示菌（致病菌）：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、李斯特菌。

1.1.2 试剂及仪器

主要试剂：脑心浸出液肉汤（BH）I，青岛高科技工业园海博生物科技有限公司提供；PI 染料，上海生物工程有限公司提供；胰蛋白胨、牛肉浸膏等其他化学试剂，国药集团化学试剂有限公司提供。

主要仪器：WT-ZNO 型超净工作台，郑州中旺实验室设备有限公司产品；智能生化培养箱，上海三发科学仪器有限公司产品；MuLtiskan GO 酶标仪，美国Thermo 公司产品；OLYMPUS IX71 型荧光倒置显微镜，广州市明美科技有限公司产品等。

1.2 试验方法

1.2.1 枯草芽孢杆菌对指示菌生物膜形成定量和定性分析

（1） 微孔板法定量。O Toole G A 等人[18]方法中，聚苯乙烯材质的96 平底孔板通常作为对体外生物膜进行定量的载体。指示菌过夜培养，分别调节菌液浓度 OD600=0.3、OD600=0.5、OD600=0.7，96 孔板每孔加入不同吸光度下指示菌菌悬液150 μL 与试验菌菌液或上清液150 μL，于37 ℃下培养24 h。移除孔内液体，pH 值为7 的PBS 缓冲液洗涤2 次，甲醇溶液固定15 min，移除孔内液体，吹干。用质量分数为0.5%的结晶紫溶液染色20 min，清除染液，pH 值为7 的PBS 缓冲液洗涤2 次，吹干。加体积分数为95%乙醇 300 μL，静置 30 min，吸出 200 μL 洗脱液到另一孔板中，酶标仪于波长570 nm 测吸光度。做5 组平行试验，并重复3 次。分别以甲醇和培养基做阳性和阴性对照。

（2） 荧光显微镜法。在直径6 cm 的玻璃培养皿中放入18 mm×18 mm 规格的无菌盖玻片，加入1 mL指示菌悬液和3 mL 试验菌悬液，于37 ℃下培养24 h，取出玻片PBS 冲洗3 次，去除表面浮游细菌，立即室温避光条件用荧光染料PI 对死菌进行染色。30 min 后，取出玻片，冲洗染液，在荧光显微镜下观察成膜情况[19]。

1.2.2 应用性试验

牛奶和蔬果防腐试验：向每个试管中加入15 mL纯牛奶，再加入300 μL 的指示菌菌液。空白对照组不加试验菌，其余分别加入500 μL DZSY21、FZB42、OKB105 菌液及其上清液。振荡混匀后置于37 ℃下培养，观察牛奶变质情况。用75%乙醇对蔬果表面消毒后，将致病菌喷洒在其表面，于37 ℃下培养4 h，分为3 组，空白组不进行操作，分别将DZSY21、FZB42、OKB105 菌液及其上清液涂抹在它们表面，再次放入37 ℃培养箱中观察腐败状况。做3 组平行试验，并重复3 次。

2 结果与分析

2.1 生物膜抑制性分析

2.1.1 生物膜形成量分析

不同OD 值指示菌生物膜形成量见图2，试验菌菌液对指示菌生物膜形成量的影响见图3，试验菌上清液对指示菌生物膜形成量的影响见图4。

图2 不同OD 值指示菌生物膜形成量

图3 试验菌菌液对指示菌生物膜形成量的影响

图4 试验菌上清液对指示菌生物膜形成量的影响

由图2 可看出，在吸光度为0.3 时生物膜形成量最多，故在后续试验在吸光度为0.3 时进行。在以培养基为阴性对照，甲醇为阳性对照的条件下，由图3可看出，枯草芽孢杆菌DZSY21 菌体抑制指示菌生物膜形成量最好，FZB42 其次，OKB105 最差。由图4 可看出，枯草芽孢杆菌DZSY21 上清液抑制指示菌生物膜形成量最好，OKB105 其次，FZB42 最差。从综合的角度来看，枯草芽孢杆菌菌体和上清液对试验菌生物膜的形成均表现出较好的抑制效果，但是枯草芽孢杆菌上清液的作用效果较菌体抑制效果差。

2.1.2 荧光显微镜定性检测生物膜构造

荧光显微镜下生物膜构造见图5。

图5 荧光显微镜下生物膜构造

由图5 可看出，A、B 和C 图分别为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和李斯特菌的生物膜构造，D、E 和F 图分别为加了DZSY21 后的生物膜构造。同一荧光强度下，未添加试验菌处理的细菌生物膜，死菌菌体成团块蘑菇状紧密地连接在一起，黑色区域为孔状通道，呈现出典型的生物膜结构。添加试验菌的指示菌生物膜都呈现出被打散抑制的情况，且DZSY21 抑制效果最好，OKB105 次之，FZB42 最差。

2.2 牛奶及蔬果防腐试验结果

牛奶防腐试验见图6，尖椒防腐试验见图7，千禧果防腐试验见图8，草莓防腐试验见图9。

图6 牛奶防腐试验

图7 尖椒防腐试验

图8 千禧果防腐试验

图9 草莓防腐试验

由图6 可看出，在37 ℃下放置5 d 后，空白组的牛奶已发生变质，出现分层，伴有明显酸味。从左到右分别为上清液和菌液 OKB105、FZB42、DZSY21，除DZSY21 试验组未见明显腐败现象外，其余都出现明显腐败状况，且OKB105 腐败最为严重，FZB42 其次。

由图7 ～图9 可看出，从左到右分别为空白组、菌液组与上清液组，喷洒致病菌的空白组腐败最为严重，而喷洒离心上清液组有较明显腐烂情况，其中腐烂情况OKB105＞FZB42＞DZSY21，喷洒菌液一组基本完好。

3 结论

在指示菌OD600为0.3 时生物膜的形成量最多，OD 值大小与生物膜形成量并非呈现正相关。抑制生物膜的试验结果表明，在OD 值恒定时，枯草芽孢杆菌DZSY21 及其上清液的抑制效果要好于另2 个试验菌，且菌体的抑制效果好于上清液。试验中，菌液和上清液对于抑制致病菌生物膜形成差别较大，且尚未发现二者的相关性。荧光显微镜下，枯草芽孢杆菌DZSY21 对致病菌生物膜具有破坏力，且对不同致病菌破坏力不同，对照组试验菌对致病菌的破坏力较弱。应用性试验中，选用易被致病菌感染或存在的蔬果和牛奶，处理后的牛奶于37 ℃下放置5 d 后，空白对照组的牛奶已明显变质，有分层现象和酸味，添加菌体的试验组腐败现象稍好于上清液组，而枯草芽孢杆菌组几乎没有变质。在蔬果的防腐试验中，经枯草芽孢杆菌处理后的试验组品相均好于其他试验组，且菌体组要好于上清液组，表现出枯草芽孢杆菌具有良好的防腐保鲜效果。尽管如此，但还需通过基因调控机制与动物临床试验进一步研究枯草芽孢杆菌DZSY21 应用于食品是否安全。